張鳳妍 謝瀟杭 李遠 張宇航

外泌體(exosomes)是一種直徑小于150 nm的細胞外囊泡，由內(nèi)體和多囊體(MVB)產(chǎn)生并釋放至細胞外環(huán)境，是細胞外囊泡中最小的一種[1]。目前定義的外泌體是1983年在羊的網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)的。網(wǎng)織紅細胞的成熟過程中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體消失，在此過程中產(chǎn)生了外泌體[2-4]。外泌體主要是通過100 000 r·min-1的超速離心收集，但離心而來的沉淀內(nèi)容物包含直徑大于外泌體的細胞外囊泡[1,5]。外泌體含有多種多樣的內(nèi)容物，包括核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等多種生物活性物質(zhì)。最初外泌體被認為是細胞來源的無用代謝物[6]，目前研究表明,外泌體在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病及眼科疾病的發(fā)病機制、病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用，同時可作為疾病診斷和治療的潛在靶點。

原發(fā)性開角型青光眼(POAG)為常見的青光眼類型之一，其發(fā)病機制近年來仍未完全闡明。目前廣為認同的機制包括機械學說、血管學說、跨篩板壓力學說以及基因突變等遺傳機制[7]，其共同之處在于致病過程中均涉及了小梁網(wǎng)(TM)、篩板細胞結構的改變及視神經(jīng)的損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體及其相關蛋白廣泛存在于房水與TM中[8]，基于其細胞間信號轉(zhuǎn)導的功能，通過影響TM與房水通路參與了POAG的發(fā)病機制，并在診斷及治療方面具有一定的潛力。本文就外泌體在POAG的發(fā)病機制、診斷及治療中發(fā)揮的作用進行綜述。

1 外泌體的形成與分離

外泌體即細胞外囊泡的分泌方式主要有兩種，一種是直接由細胞膜而來，另外一種則是多囊體和細胞膜融合后再釋放至細胞外[9-10]。外泌體主要儲存于細胞內(nèi)，釋放入細胞外基質(zhì)(ECM)中，通過體液作用于靶細胞進而發(fā)揮生物學功能。細胞內(nèi)膜系統(tǒng)廣泛參與到外泌體的形成以及釋放過程中，多囊泡內(nèi)體向細胞器內(nèi)腔包裹內(nèi)陷形成腔內(nèi)小泡(ILV)[11]。在這其中，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復合體(ESCRT)起到了關鍵作用。ESCRT最早定義為酵母中泛素依賴的蛋白質(zhì)分選通路。ESCRT包括四種不同的復合體(ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III)和相關蛋白質(zhì)(包括VPS4VTA1和ALIX)[12]。多泡內(nèi)體與細胞膜融合后進而將ILV作為外泌體釋放出去。目前認為外泌體釋放途徑主要有ESCRT依賴型和ESCRT非依賴型，但是兩者并不能完全區(qū)分開來[13-14]。先前提到在超速離心后得到的內(nèi)容物中包含有比外泌體直徑更大的細胞外囊泡，因此，如何提高外泌體的產(chǎn)量以及所獲得外泌體的質(zhì)量成為近期外泌體分離相關研究的關鍵。外泌體分離的方法主要有六種，分別為超速離心法、超濾法、免疫親和捕獲技術、基于電中和的聚合物沉淀法、分子排阻色譜法以及微流控技術[15]。不同方法之間各有千秋。目前公認的外泌體分離的“金標準”仍然為超速離心法[16]。

2 外泌體參與POAG的發(fā)病機制

既往認為POAG的發(fā)生發(fā)展同房水循環(huán)障礙所致的高眼壓相關，從而衍生出機械學說和血管學說[7]。作為POAG發(fā)病的主要危險因素，高眼壓與房水流出阻力上升、ECM周轉(zhuǎn)失衡密切相關。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為細胞外囊泡可運輸多種POAG相關細胞因子和蛋白參與房水循環(huán)，且在一項針對POAG患者TM組織的基因表達研究中發(fā)現(xiàn)，多種外泌體成分的基因表達與健康者存在差異，提示外泌體通路的異?？赡軈⑴c了POAG的發(fā)生[17]。

2.1 外泌體參與運輸POAG相關生物活性物質(zhì)目前已有多項研究針對POAG患者的TM組織及房水樣本進行了蛋白組學分析，其中有多項外泌體蛋白及外泌體相關的表達出現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的變化，為了解POAG發(fā)病機制提供了新的思路。

MYOC是一種與POAG發(fā)病相關的基因[18]，3%～4%的POAG與其突變相關[19]。MYOC編碼一種名為myocilin的分泌蛋白，早期認為myocilin的分泌方式遵從傳統(tǒng)分泌模式，即經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的翻譯后修飾。而Hardy等[20]于2005年發(fā)現(xiàn)，myocilin是經(jīng)過一種與外泌體樣囊泡相關聯(lián)的分泌方式從TM釋放，當多泡體與細胞質(zhì)膜融合時，myocilin則與外泌體一起從培養(yǎng)的TM細胞中釋放。myocilin在房水中含量豐富，參與細胞內(nèi)外的蛋白水解過程[21]，并呈現(xiàn)出與外泌體相似的生化特征[22]，提示外泌體通過運輸myocilin參與眼壓的調(diào)節(jié)。Hoffman等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在TM細胞內(nèi)，myocilin相關外泌體的產(chǎn)生受皮質(zhì)類固醇、鈣離子載體和房水成分的調(diào)控，提示TM細胞通過釋放myocilin相關外泌體來對環(huán)境信號作出應答。突變的myocilin被認為同POAG發(fā)病相關，一方面，TM過度產(chǎn)生或分泌myocilin可能會致其在TM內(nèi)異常積聚，房水流出阻力增加，眼壓升高[24]。另外，一項在大鼠POAG模型中的研究表明，突變的myocilin可誘導細胞凋亡，導致TM功能障礙，引發(fā)眼壓升高[25]。 此外，也有研究通過檢測POAG患者的TM基因表達，發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)病變誘導反應蛋白基因(OPTN)、WDR36等POAG相關致病基因表達的蛋白可能通過外泌體釋放途徑參與POAG 發(fā)生[17]。

部分細胞因子也可經(jīng)外泌體釋放途徑參與POAG發(fā)生。TGF-β2為一種與 POAG有顯著關聯(lián)的細胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)，50%的POAG患者的房水中TGF-β2表達上調(diào)[29]。TGF-β2可存在于外泌體當中，細胞外結構中含有TGF-β2的外泌體參與了POAG的發(fā)病過程。同時有研究表明，間充質(zhì)干細胞(MSC)來源的外泌體中含有miR-27b，通過抑制TGF-β2信號通路參與到上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的過程中，因此猜想含有miRNA的外泌體通過影響TGF-β2的分泌進而調(diào)控眼壓的穩(wěn)定，參與POAG的發(fā)病過程[30]。

2.2 外泌體參與調(diào)控ECM周轉(zhuǎn)POAG的主要特征為ECM在眼部血管及TM的病理性積聚和重塑，具體表現(xiàn)為，TM內(nèi)的纖維連接蛋白(Fn)表達增加，ECM中的纖維和其他成分黏附于彈性纖維鞘，使纖維鞘衍生斑塊的數(shù)量遠超正常狀態(tài)[31]。且斑塊內(nèi)皮下層的彈性纖維不規(guī)則增厚，多余的纖維組織黏著在TM網(wǎng)狀組織，使房水的流出通道被阻塞，增加房水流出阻力，導致眼壓升高[31]，引發(fā)POAG。

有研究顯示，外泌體可通過侵襲性偽足結構及介導基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)調(diào)節(jié)ECM的局部周轉(zhuǎn)和重塑[32]。人TM細胞存在MMP-2和MMP-14共定位的區(qū)域(MMP-2是目前唯一確定的定位于TM的外泌體型蛋白[33])，呈侵襲性偽足樣結構[34]，是一種具有高度活性的細胞器，含有豐富的MMPs，為局部ECM降解和重塑的位點。人TM細胞產(chǎn)生的外泌體可與Fn結合，與Fn結合后的外泌體可以在侵襲性偽足的細胞結構中調(diào)節(jié)ECM的局部周轉(zhuǎn)與降解，維持房水的正常引流[32]，另外，包含MMPs的細胞外囊泡也可以直接參與ECM周轉(zhuǎn)，使特化的細胞突起(侵襲性偽足)具有降解能力[8]。

Hoshino等[35]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的分泌活動對于侵襲性偽足的形成和功能發(fā)揮十分重要，純化的外泌體可以誘導侵襲性偽足的形成，而侵襲性偽足的成熟和ECM的降解可能依賴于膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1 (MT1-MMP) 和其他蛋白酶通過外泌體的傳遞，呈現(xiàn)正反饋回路。

外泌體同樣可參與MMPs活性的調(diào)控，其攜帶的TGF-β2在進行TM組織培養(yǎng)時，可通過在組織中合成較多的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶將蛋白質(zhì)交聯(lián)成不能被MMPs降解的復合物和抑制MMPs活化的纖維蛋白溶酶原激活劑抑制因子(PAI)[36]。PAI-1的增加會導致MMP-2活性降低，并可能導致患者TM的ECM增加[36]。

2.3 外泌體與小膠質(zhì)細胞相互作用介導視神經(jīng)損傷POAG的基礎病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)損傷，而炎癥同視神經(jīng)的損傷及青光眼的發(fā)生發(fā)展密切相關。近年來針對視神經(jīng)退行性變的研究表明，小膠質(zhì)細胞可參與POAG的發(fā)病機制。有研究發(fā)現(xiàn)，在POAG患者中，小膠質(zhì)細胞的吞噬作用可促進RGC死亡[37]。小膠質(zhì)細胞的外泌體與受體小膠質(zhì)細胞可相互作用，Aires等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在高靜水壓條件下，培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞外泌體釋放量增加一倍，且從中分離的外泌體可使受體小膠質(zhì)細胞分泌IL-1β、TNF等促炎癥反應細胞因子，并促進細胞的運動和吞噬功能，而在原代RGC培養(yǎng)中，小膠質(zhì)細胞的外泌體也可誘導氧化應激與細胞死亡。以上研究提示，小膠質(zhì)細胞間或存在一個由外泌體介導的細胞間通訊系統(tǒng)傳播炎癥反應信號，而外泌體介導神經(jīng)節(jié)細胞死亡的機制目前尚不清楚。

3 外泌體與POAG的診斷

生物標志物被定義為在組織、細胞或液體等生物介質(zhì)中可測量的生化、分子或細胞改變，代表正?；虿±磉^程的指標，或?qū)χ委煾深A的反應。外泌體中存在豐富的生物活性物質(zhì)，并具有一定的耐寒性，近年來通過分離外泌體內(nèi)組分從而獲得生物標志物的研究不斷增加。

在一項針對POAG患者的房水蛋白組學分析中發(fā)現(xiàn)，同健康者相比，POAG患者的房水中幾種外泌體蛋白，如炎癥蛋白(ELAM1)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的蛋白(Apo B和Apo E)、熱休克蛋白(HSP60和HSP90)的表達顯著升高[26,28]。明確這些外泌體相關生物標志物一方面反映了炎癥、氧化應激等因素對疾病發(fā)生發(fā)展的影響，另一方面可為診斷POAG提供參考。

4 外泌體與POAG的治療

青光視神經(jīng)病變同視神經(jīng)損傷類似，其特點為選擇性死亡，不可逆性的退行性變。目前POAG中RGC死亡的機制仍不明確，而部分集中于細胞及通路的研究表明，其損傷或與免疫細胞募集、小膠質(zhì)細胞的吞噬作用相關[37]。因而，當下針對青光眼，各類防治手段的最終目的便是減輕RGC的功能障礙，減少并預防視神經(jīng)萎縮。如前文所述，外泌體可攜帶包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)在內(nèi)的多種細胞活性物質(zhì)，在細胞周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用，因而具有潛在的治療價值。

近年來，伴隨著外泌體研究的不斷深入，其在信號轉(zhuǎn)導之外的作用也不斷被發(fā)現(xiàn)。研究表明，間充質(zhì)干細胞可分泌一種攜帶DNA、miRNA、蛋白質(zhì)等成分的細胞外囊泡，其可以介導旁分泌，并具有強大的治療潛力，這類基于MSC衍生的外泌體(MSC-Exos)治療方法副作用較小，但也有研究表明治療過程中有引起同種異體免疫應答的風險[39]。有研究者將骨髓MSC外泌體移植到三種不同的青光眼動物模型(激光光凝小鼠模型、微球前房注射小鼠模型和遺傳DBA/2青光眼J小鼠模型)的玻璃體中，三種模型中骨髓MSC中外泌體均顯著促進RGC的存活，同時防止其功能衰退，并對軸突有一定的保護作用，其作用機制是將外泌體相關mRNA轉(zhuǎn)運入RGC內(nèi)進行表達[40]。此外，外泌體在每月給藥的情況下，療效可長期維持。

5 總結與展望

外泌體目前已成為多學科研究的熱點，近年來針對其與眼部疾病的相關研究不斷增加。在POAG的發(fā)生發(fā)展中，外泌體可作為載體運輸多種生物活性物質(zhì)，并可經(jīng)囊泡轉(zhuǎn)運參與細胞通路間信號轉(zhuǎn)導，其同小膠質(zhì)細胞的相互作用介導了RGC損傷。外泌體在診斷和治療領域具有較大潛能，但目前存在一定局限性。比如房水樣本分析為有創(chuàng)檢測，且所用的分析方法不能完全純化外泌體，因而還不能將其應用于POAG的診斷；而針對受損RGC的MSC-Exos治療方案尚未進入臨床階段，并且僅能依照功能細胞的表達來判斷是否有效，并未探明具體的細胞靶點，未來仍需進一步研究及觀察。