丁劍鋒 楊煒 李璐 司超

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病主要慢性并發(fā)癥之一，其與視網(wǎng)膜炎癥、氧化應激及微血管病變密切相關。DR可引起視網(wǎng)膜炎癥和微血管病變，進而導致糖尿病患者視力減退甚至致盲[1-4]。目前針對DR的主要治療方式為玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物，但其價格昂貴，導致患者經(jīng)濟負擔加重。因此開發(fā)療效更好、性價比更高的藥物對于預防和治療DR十分必要。

肝X受體為一種核受體，其激動劑TO901317可以通過啟動ABCA1轉(zhuǎn)錄，抑制核因子κB活性，從而下調(diào)白細胞介素(IL)-1β、IL-6、iNOS、COX2等炎癥因子表達，上調(diào)抑炎因子IL-10的表達，進而在腦、肺和視網(wǎng)膜等組織器官發(fā)生缺血缺氧損傷時發(fā)揮一定的抗炎作用[5-9]。研究證明，IL-1β、IL-6和VEGF是DR患者視網(wǎng)膜新生血管形成的關鍵影響因素[10-12]，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，激活ABCA1能抑制 IL-1β 的表達，在缺血缺氧刺激因素作用下對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有一定的保護作用[13]。但肝X受體激動劑TO901317與DR的發(fā)生發(fā)展是否有密切關系目前鮮有報道。本研究通過分析TO901317對DR模型大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)、新生血管形成及視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6和VEGF表達的影響，探討TO901317對DR大鼠視網(wǎng)膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物取24只健康SPF級SD大鼠(購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心)，雌雄不拘，體重180～220 g，鼠齡8～12周，隨機分為正常組、模型組、TO901317組，每組各8只。動物飼養(yǎng)于石河子大學醫(yī)學院動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，飼養(yǎng)濕度45%～55%，實驗動物在安靜環(huán)境下自由進食和飲水。飼養(yǎng)及實驗過程嚴格按照《石河子大學醫(yī)學倫理委員會條例》進行。

1.1.2 實驗試劑及儀器RNeasy Mini Kit 試劑盒(德國 Qiagen 公司)，β-actin一抗、二抗(北京中杉金橋公司)，ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6一抗和TO901317(美國 Sigma公司)，ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6引物(上海生工生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(美國 Promega公司)，IL-1β 、IL-6 ELISA試劑盒(美國ADL公司)，CFX96Touch實時熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 各組大鼠處理正常組大鼠不做任何處理；模型組、TO901317組大鼠在禁食24 h后測量空腹血糖濃度，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素60 mg·kg-1，1周后采尾靜脈血檢測空腹血糖濃度。此后每月檢測空腹血糖濃度1次，以空腹血糖濃度持續(xù)24周高于16.7 mmol·L-1作為造模成功的標準； TO901317組大鼠在造模后第25周時一次性雙眼玻璃體內(nèi)注射5 μL TO901317(3.125 g·L-1)，正常組、模型組大鼠此階段不做任何處理。

1.2.2 空腹血糖濃度檢測各組大鼠造模前和造模結束時，均于禁食24 h后采集尾靜脈血，以羅氏血糖儀檢測空腹血糖濃度，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 視網(wǎng)膜標本制備造模結束并檢測空腹血糖濃度后以10 g·L-1水合氯醛 0.6 g·kg-1腹腔內(nèi)注射過量麻醉處死各組大鼠，迅速摘取雙側眼球于動物手術顯微鏡下在冰面上迅速鈍性分離視網(wǎng)膜，一側眼球的視網(wǎng)膜浸入4 g·L-1多聚甲醛固定液中固定24 h，按照常規(guī)步驟脫水、透明、浸蠟和包埋，用于HE染色；另一側眼球放置于液氮中保存，用于ELISA、實時熒光定量PCR和Western blot實驗。

1.2.4 HE染色制作平行于視神經(jīng)的連續(xù)矢狀眼球切片，片厚4 μm，攤片、烤片后用二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，蘇木精初染2 min，用體積分數(shù)0.1%鹽酸乙醇分化5 s，1 g·L-1氨水返藍5 s，0.5 g·L-1伊紅液復染4 min，脫水、透明后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結構和微血管變化情況，測量各組大鼠視網(wǎng)膜厚度。

1.2.5 ELISA法檢測大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量取出部分液氮內(nèi)凍存的視網(wǎng)膜組織，嚴格按照IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒操作步驟檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)IL-1β、IL-6含量。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對表達量取適量大鼠視網(wǎng)膜組織冰上剪碎研磨后，利用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取各組大鼠視網(wǎng)膜組織總RNA，檢測合格后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，按相應試劑盒說明書步驟擴增ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA，選取β-actin為內(nèi)參，具體引物序列見表1。每組設置3個復孔，按照95 ℃ 30 s(預變性)，95 ℃ 10 s(變性)，60 ℃ 20 s(退火)，75 ℃ 20 s(延伸)進行40個循環(huán)，以β-actin基因為內(nèi)參，以2-△△Ct法計算ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF mRNA的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白表達水平取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，用生理鹽水清洗后于EP管內(nèi)在冰上將組織剪碎，加入蛋白裂解液進行組織裂解，提取蛋白后用BCA法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉4 h，分別加入稀釋的目的蛋白ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF和內(nèi)參β-actin一抗(11000)，置于4 ℃搖床上孵育過夜后加入相應二抗(15000)，用TBST洗膜3次，每次10 min，隨后置于暗室內(nèi)發(fā)光、壓片、曝光、顯影、定影，采集圖像，用ImageJ 1.8.0分析各組蛋白條帶灰度值，利用內(nèi)參進行蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠造模前后空腹血糖濃度造模前各組大鼠空腹血糖濃度比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；造模后模型組和TO901317組大鼠空腹血糖濃度均較各自造模前和正常組造模后明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠造模前后空腹血糖濃度

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及厚度變化正常組大鼠視網(wǎng)膜各層組織間連接緊密，細胞排列整齊，各細胞形態(tài)及微血管結構正常。模型組和TO901317組大鼠視網(wǎng)膜可見內(nèi)界膜腫脹斷裂嚴重，部分內(nèi)皮細胞突出內(nèi)界膜，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層細胞減少明顯，微血管結構遭到破壞，內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層細胞數(shù)量也減少，排列稀疏；兩組大鼠視網(wǎng)膜厚度均較正常組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；TO901317組大鼠視網(wǎng)膜各層結構改變介于正常組與模型組之間，視網(wǎng)膜厚度較模型組明顯變薄，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1和表3)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織切片HE染色結果 GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度和視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6的含量

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量與正常組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β和IL-6含量均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；TO901317組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β和IL-6含量較模型組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表3)。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對表達量模型組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1的mRNA相對表達量較正常組和TO901317組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對表達量較正常組和TO901317組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相對表達量

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白相對表達量模型組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1蛋白相對表達量均較正常組和TO901317組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6和VEGF蛋白相對表達量均較正常組和TO901317組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見圖2和表5)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白表達情況

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白相對表達量

3 討論

DR是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，主要損傷視網(wǎng)膜的結構和功能，造成患者視力損害甚至喪失，嚴重影響中老年糖尿病患者的健康和生活。DR主要與視網(wǎng)膜脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應和微血管病變有關[14-16]。DR發(fā)生發(fā)展過程中視網(wǎng)膜長期處于慢性炎癥狀態(tài)，炎癥因子表達升高，以IL-1β和IL-6升高最為突出[17-18]。視網(wǎng)膜炎癥一方面造成視網(wǎng)膜水腫，視網(wǎng)膜各層結構與細胞腫脹，排列疏松；另一方面長期炎癥反應使視網(wǎng)膜血管壁結構與通透性遭到破壞，產(chǎn)生微血管瘤，造成視網(wǎng)膜供血不足，組織缺血缺氧，進一步加重了炎癥反應和視網(wǎng)膜損傷。受損的視網(wǎng)膜血管引發(fā)代償性新生血管形成，但視網(wǎng)膜新生血管無正常的血管功能及結構，易發(fā)生破裂出血，出血部位易發(fā)生機化進而造成視網(wǎng)膜裂孔和脫離，造成患者視力減退甚至喪失[19-20]。VEGF在促進細胞增殖和新生血管形成中發(fā)揮重要作用[21-22]。研究證明，DR患者視網(wǎng)膜新生血管的嚴重程度與眼內(nèi)VEGF的水平密切相關，玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物(雷珠單抗、康柏西普)可以下調(diào)視網(wǎng)膜VEGF表達，抑制視網(wǎng)膜新生血管形成[23]，抗VEGF已成為目前眼科臨床治療DR的一線方法。但因其價格昂貴，患者經(jīng)濟負擔較大，尋找新的可以抑制DR患者視網(wǎng)膜炎癥且抗新生血管形成的藥物仍迫在眉睫。

肝X受體是一種核受體，在人類和小鼠視網(wǎng)膜上均有表達[24]。肝X受體通過激活并上調(diào)ABCA1的表達進而下調(diào)核因子κB的表達，在一定程度上可抑制炎癥反應，同時激活的ABCA1在ATP作為能量供體的情況下，可促進細胞內(nèi)膽固醇、游離磷脂的排出，從而發(fā)揮抗炎作用。當ABCA1轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙時可導致細胞內(nèi)膽固醇聚集形成泡沫細胞，入侵血管壁后也會促進血管硬化[25]。已有研究證實，非特異性肝X受體激動劑TO901317可以激活ABCA1，下調(diào)葡萄膜炎小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子的表達，從而起到抗炎和保護視神經(jīng)的作用[26]。

本研究通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備大鼠DR模型，注射后24周檢測大鼠空腹血糖濃度發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血糖濃度明顯升高，達到糖尿病造模水平。通過HE染色發(fā)現(xiàn),模型組大鼠視網(wǎng)膜組織結構腫脹、細胞排列疏松、視網(wǎng)膜厚度明顯增加、微血管結構受損，證明DR大鼠模型制備成功。通過檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量明顯升高， IL-1β、IL-6在mRNA和蛋白水平上表達均升高，說明DR大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生炎癥反應，炎癥因子表達升高，炎癥反應一定程度上導致視網(wǎng)膜組織腫脹，細胞排列疏松。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠視網(wǎng)膜ABCA1 mRNA和蛋白表達較正常組均明顯降低，VEGF mRNA和蛋白表達較正常組均明顯升高，結合HE染色結果，說明炎癥反應、ABCA1表達下降和VEGF表達升高可導致視網(wǎng)膜血管壁結構異常，通透性增加，同時也促進了新生血管形成。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在DR大鼠模型制備成功后給予3.125 g·L-1肝X受體激動劑TO901317玻璃體內(nèi)注射后，大鼠視網(wǎng)膜各層組織腫脹、細胞排列疏松等視網(wǎng)膜損傷表現(xiàn)較模型組得到一定緩解，視網(wǎng)膜厚度也有所降低；進一步檢測發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜IL-1β、IL-6含量較模型組下降，視網(wǎng)膜ABCA1 mRNA和蛋白表達較模型組均明顯升高，IL-1β、IL-6和VEGF mRNA和蛋白表達均較模型組明顯降低。這些結果說明，玻璃體內(nèi)注射TO901317可以上調(diào)ABCA1表達，在一定程度上抑制DR大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應，降低炎癥因子IL-1β、IL-6的高表達，緩解視網(wǎng)膜組織腫脹、厚度增加和細胞排列疏松等病理學改變，同時也可以抑制VEGF的高表達，在一定程度上降低DR大鼠視網(wǎng)膜血管損傷和新生血管形成。

綜上所述，肝X受體激動劑TO901317可以上調(diào)ABCA1表達，下調(diào)IL-1β、IL-6和VEGF表達，抑制DR大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應和新生血管形成，對DR大鼠視網(wǎng)膜有一定保護作用。這為DR的預防和治療提供了新的藥物研究方向。