饒家瑞，雷志偉，周玉鋒

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茶葉是人們喜愛的飲品，并具有一定的保健和藥用價值[1-2]。貴州種茶歷史悠久[3]，并為貴州的經(jīng)濟發(fā)展做出了一定貢獻。茶葉品質(zhì)是貴州茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的生命線，也是搶占國內(nèi)外茶市場的核心指標。近年來，隨著茶產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，貴州茶樹病害加重，尤以茶輪斑病危害較重[4]，而安全綠色農(nóng)藥的合理利用是防治茶樹病害和確保茶葉安全生產(chǎn)的重要措施[5-6]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找對環(huán)境友好的抗茶輪斑病綠色農(nóng)藥，對貴州茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人對不同農(nóng)作物不同病害的綠色農(nóng)藥應(yīng)用及合成進行了諸多研究[7-9]，姚亞麗等[7]研究顯示，中生菌素具有廣譜抑菌活性，對茶葉病害具有一定的抑制作用；YOSHIKAWA等[8]研究表明，萎銹靈對植物真菌病害有一定防治效果；WANG等[9]采用二元活性拼接法，用水楊醛和不同取代基苯丙炔構(gòu)建系列化合物，并從中鑒定出化合物1a抗菌核病、蘋果樹腐爛病菌和灰葡萄孢菌的生物活性優(yōu)于對照藥物百菌清?！狙芯壳腥朦c】雖然作物生產(chǎn)上已應(yīng)用的中生菌素、萎銹靈等高效低毒農(nóng)藥比一般農(nóng)藥[10-11]的用量更小，殘留更低，但隨著作物病害耐藥性的增強及其病害嚴重情況下的超量施用，已造成農(nóng)藥殘留超標和環(huán)境污染問題，進而也影響貴州茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量的提高。目前除少數(shù)植物源天然產(chǎn)物農(nóng)藥(如除蟲菊酯)外，多數(shù)均是對其化學結(jié)構(gòu)進行修飾改性后的產(chǎn)物，雖具有較高的抗菌活性，但是部分農(nóng)藥殘留仍是一個難題。自然界的諸多植物均具有抗菌消炎作用，從中提取的天然產(chǎn)物除具有殺菌作用外，還可被植物自身很好降解，同時解決農(nóng)藥殘留問題。因此，從天然產(chǎn)物中篩選高活性農(nóng)藥應(yīng)用于茶葉生產(chǎn)意義重大?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在天然產(chǎn)物中，從其化學結(jié)構(gòu)含有醛基[12]、酚類[13]和多羥基[14-15]基團的物質(zhì)中篩選到具有較高生物抗菌活性的可能性較大。因此，選擇含有以上化學結(jié)構(gòu)的10種天然產(chǎn)物篩選抗茶輪斑病的生物活性，并利用掃描電子顯微鏡(SEM)探尋活性最優(yōu)天然產(chǎn)物潛在的抗茶輪斑病活性機制，以期尋找天然產(chǎn)物中具有抗茶輪斑病活性的化合物，為降低茶葉農(nóng)藥殘留和提高貴州茶葉品質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶輪斑病菌 茶輪斑病菌是采用單孢分離法結(jié)合形態(tài)學與分子生物學鑒定方法分離鑒定所得菌株，測序結(jié)果為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)的Pestalotiopsissydowiana病菌[16-17]，由貴州省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所提供。

1.1.2 藥劑 10種天然產(chǎn)物的名稱、結(jié)構(gòu)式及來源見表1。其中，香草醛、丁香醛、愈創(chuàng)木酚和百里香酚購于上海阿拉丁試劑有限公司，吲哚購于上海九鼎化學有限公司，槲皮素、香葉木素和芹菜素購于上海麥克林有限公司，肉桂酸和L-薄荷購于上海樂研試劑有限公司。98%萎銹靈購于上海麥克林有限公司，無水乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司，吐溫-80購于天津市大茂化學試劑廠，土豆培養(yǎng)基(PDA)購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試劑均購于上海安耐吉化學試劑有限公司。通過Sarfori-us型電子天平(精度0.0010 g)完成藥品稱量。

表1 10種天然產(chǎn)物的名稱、結(jié)構(gòu)式及來源

1.1.3 儀器 Nova NanoSEM 450掃描電子顯微鏡，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備儀；20～200 μL、100～1000 μL和1～5 mL移液槍，電子天平。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗共設(shè)12個處理，按天然產(chǎn)物相應(yīng)編號分設(shè)10個處理；處理11，陽性對照(CK1)，萎銹靈農(nóng)藥；處理12，空白對照(CK2)，等量二甲基亞砜(DMSO)吐溫水。3次重復，隨機排列。

1.2.2 抗茶輪斑病的生物活性初篩

1) 培養(yǎng)基的配制。稱取 800 g去皮土豆放入4.5 L清水中，熬煮后濾去土豆殘渣，加入80 g瓊脂、80 g葡萄糖、12 g磷酸二氫鉀、6.0 g硫酸鎂和40 mg維生素B1，混勻溶解后以每瓶 90 mL轉(zhuǎn)移到 250 mL錐形瓶中，封口后在 121℃條件下高壓滅菌 20 min，冷卻后得PDA培養(yǎng)基備用。馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB) 參照HOU等[18]的方法配制。

2) 藥液配制。稱取各待測天然產(chǎn)物 10 mg分別溶解到 0.5 mL DMSO中，后轉(zhuǎn)移至含4.5 mL無菌吐溫水的15 mL離心管中，再將其加入制備好的45 mL PDA培養(yǎng)基中，混勻，得到天然產(chǎn)物的最終濃度為100 μg/mL。將含有各種待測天然產(chǎn)物的培養(yǎng)基分別平均倒入3個培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 抗茶輪斑病抑制率的測定。采用菌絲生長速率法[19]測定10種天然產(chǎn)物對茶輪斑病的抑制率。先在提前活化好的病菌邊緣打孔制取直徑為 4.0 mm的菌餅，再用無菌接種針將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，置于 28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d，空白對照組菌落長到 6.0 cm左右時，采用十字交叉法用直尺測量菌落直徑，計算其抑制率。

抑制率=[(對照組凈菌落直徑-處理組凈菌落直徑)/對照組凈菌落直徑]× 100%

1.2.3 抗茶輪斑病EC50的測定 根據(jù)10種天然產(chǎn)物抗茶輪斑病活性的初篩結(jié)果，先將活性較好各待測天然產(chǎn)物配置成濃度為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL的5梯度藥液，并采用菌絲生長速率法測定對應(yīng)茶輪斑病菌的抑菌活性，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，并以天然產(chǎn)物濃度的對數(shù)為自變量(x)，相對抑制率為因變量(y)，擬合活性較好天然產(chǎn)物對茶輪斑病的線性回歸方程，計算各天然產(chǎn)物的抑制率、抑制中質(zhì)量濃度(EC50)及相關(guān)系數(shù)(R)。根據(jù)EC50判斷天然產(chǎn)物的毒力大小，即天然產(chǎn)物的EC50越小，其對茶輪斑病菌的毒力越強。

1.2.4 對茶輪斑病菌細胞外壁損傷程度的觀察 用RAO等[20]稍加修改的電鏡制樣方法，采用掃描電子顯微鏡觀察篩選出的高活性天然產(chǎn)物作用于茶輪斑病，然后觀察病菌細胞外壁的損傷程度。

先將茶輪斑病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃暗箱培養(yǎng)7 d。用打孔器從 PDA培養(yǎng)基邊緣生長旺盛部位打孔，取菌餅接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)中，25℃、180 r/min搖床暗箱培養(yǎng)7 d。取1 mL長滿菌絲的PDB培養(yǎng)基于1.5 mL離心管中離心，然后用PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌，以獲得懸浮在PBS緩沖液中的菌絲。用200 μg/mL和500 μg/mL濃度的天然產(chǎn)物在DMSO中于震蕩條件下處理茶輪斑病菌絲6～8 h，用PBS沖洗菌絲3次，再用適量2.5%戊二醛在4℃固定8 h，然后依次用適量乙醇和叔丁醇處理10 min。冷凍干燥和鍍金后，樣品在Nova NanoSEM 450掃描電子顯微鏡下成像，觀察藥物作用后真菌細胞外壁的損傷程度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 10種天然產(chǎn)物對茶輪斑病菌的抑制率

由圖1看出，在100 μg/mL濃度下，茶輪斑病菌在10種天然產(chǎn)物藥液中均能生長。由表2可知，菌落直徑為CK2>處理6>處理8>處理10>處理7>處理1>處理9>CK1>處理2>處理5>處理3>處理4。除空白對照(CK2)外，以處理6的菌落生長最快，培養(yǎng)5 d菌落的直徑為7.0 cm；處理4最慢，為1.3 cm；菌落直徑小于陽性對照(CK1)的有處理2～處理5。10種天然產(chǎn)物對茶輪斑病菌的抑制率以處理4最高，為82.67%，較CK1增加48百分點；處理3其次，為65.33%，較CK1增加30.66百分點；處理5第3，為57.33%，較CK1增加22.66百分點；處理2第4，為42.67%，較CK1增加8百分點，且均極顯著高于CK1。其余6個處理的抑制率均極顯著低于CK1。說明，百里香酚、愈創(chuàng)木酚、吲哚和丁香醛4種天然產(chǎn)物抗茶輪斑病的活性均較好，并以百里香酚的抗菌活性最強。

表2 在100 μg/mL濃度下10種天然產(chǎn)物對茶輪斑病菌的抑制率

注：a為香草醛，b為丁香醛，c為愈創(chuàng)木酚，d為百里香酚，e為吲哚，f為槲皮素，g為香葉木素，h為芹菜素，i為肉桂酸，j為L-薄荷醇，CK1為陽性對照萎銹靈，CK2為空白對照。

2.2 3種活性較高天然產(chǎn)物對茶輪斑病的毒力強度

2.2.1 毒力回歸方程 通過擬合得到百里香酚、愈創(chuàng)木酚和吲哚3種天然產(chǎn)物對茶輪斑病病原菌的毒力方程 (表3)：y愈創(chuàng)木酚= 1.517 7x+ 2.335 5(R=0.981 2)，y百里香酚= 1.731 6x+2.352 8(R=0.965 0)，y吲哚= 1.934 3x+ 1.368 4(R=0.958 9)，相關(guān)系數(shù)均>0.95，表明3種天然產(chǎn)物藥劑濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系。

2.2.2 毒力強度 從表3可知，3種天然產(chǎn)物的EC50為33.79～75.42 μg/mL。其中，以百里香酚對茶輪班病的毒力強度最大，EC50為33.79 μg/mL；愈創(chuàng)木酚其次，EC50為56.97 μg/mL；吲哚第3，EC50為75.42 μg/mL。

表3 3 種天然產(chǎn)物對茶輪斑病病原菌的毒力回歸方程及EC50

3種天然產(chǎn)物的EC50用藥量依次比CK1減少197.73 μg/mL、174.55 μg/mL和156.10 μg/mL。表明，3種天然產(chǎn)物抗茶輪斑病的效果均較好。

2.3 百里香酚處理茶輪斑病真菌細胞外壁的損傷情況

由圖2看出，百里香酚濃度為200 μg/mL處理茶輪斑病菌，可導致其表面形態(tài)從光滑圓潤變?yōu)椴糠至验_(圖2-a)，并可見孔狀形狀 (圖2-b)；當處理濃度為500 μg/mL時，其細胞壁損壞的程度更加明顯，許多細胞破裂 (圖2-c)。表明，百里香酚引起了病菌細胞體系列生理變化，并導致其細胞受損死亡。

3 討論

茶輪斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)又稱為茶梢枯死病，是貴州茶樹葉部的主要病害之一[21-22]，其病原菌存在多樣性，包括山茶花擬盤多毛孢 (Pestalotiopsiscamelliae)、茶假擬盤多毛孢(Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis)和新擬盤多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)[23-24]，該病害是致使茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量下降的主要原因之一。張欣等[17]探明了茶輪斑病病原菌Pestalotiopsistrachicarpicola的生物學特性，為茶輪斑病防治藥劑的篩選提供了參考。10種天然產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)中主要包含有苯環(huán)、環(huán)己烷和苯并雜環(huán)，并以苯環(huán)上連接異丙基、甲基和羥基等給電子基團的百里香酚抗茶輪斑病的生物活性最佳，EC50為33.79 μg/mL。因此，接下來的研究將以骨架結(jié)構(gòu)為苯環(huán)，且取代基以供電子基為主的香芹醇和丁香酚等天然產(chǎn)物為目標，希望從中繼續(xù)篩選出活性更高的抗茶輪斑病天然產(chǎn)物，為研發(fā)結(jié)構(gòu)新穎的抗茶輪斑病綠色農(nóng)藥提供新的先導化合物。

4 結(jié)論

研究10種天然產(chǎn)物(香草醛、丁香醛、愈創(chuàng)木酚、百里香酚、吲哚、槲皮素、香葉木素、芹菜素、肉桂酸和L-薄荷)在100 μg/mL濃度下抗茶輪斑病的生物活性，結(jié)果顯示，百里香酚、愈創(chuàng)木酚和吲哚對茶輪斑病的抑制率分別為82.67%、65.33%和57.33%，比陽性對照萎銹靈(34.67%)分別增加48百分點、30.66百分點和22.66百分點，差異均達極顯著，其EC50分別為33.79 μg/mL、56.97 μg/mL和75.42 μg/mL，比陽性對照萎銹靈(231.52 μg/mL)的EC50劑量分別減少197.73 μg/mL、174.55 μg/mL和156.10 μg/mL。

通過高活性天然產(chǎn)物百里香酚作用于茶輪斑病后病菌細胞外壁的損傷程度觀察顯示，在200 μg/mL濃度時，百里香酚可導致茶輪班病真菌細胞壁的表面形態(tài)從光滑圓潤變?yōu)椴糠至验_；在500 μg/mL濃度時，百里香酚真菌細胞壁的受損程度明顯增加并導致其細胞死亡。因此，百里香酚可用于茶輪斑病的生物防治，其次可選擇愈創(chuàng)木酚和吲哚，也能較好地防治茶輪斑病。