李歡 李揚(yáng) 杜娟 郭麗梅

1北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科，北京 100191；2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100191

PDAC是全球第七大癌癥相關(guān)死亡原因[1]，預(yù)計(jì)到2030年將成為癌癥死亡的第二大原因[2]。PDAC手術(shù)切除率低，對(duì)放化療敏感度差，大多數(shù)靶向治療的臨床效果不滿意。因此，需要尋找潛在的分子標(biāo)志物來(lái)幫助PDAC的早期診斷和靶向治療。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican1，GPC1)在前列腺癌[3]、肝癌[4]、食管癌[5]及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]等腫瘤組織中異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究報(bào)道GPC1陽(yáng)性的循環(huán)外泌體可以區(qū)分PDAC和胰腺良性疾病患者，特異性和敏感性接近100%[7]。本研究檢測(cè)PDAC組織GPC1的表達(dá)，分析其與臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性，探討GPC1對(duì)PDAC臨床診斷及治療的價(jià)值。

材料與方法

一、胰腺組織標(biāo)本

收集2015年1月至2018年12月間北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科存檔的125例PDAC組織石蠟標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的癌旁正常胰腺組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未接受新輔助化療、放療等其他抗腫瘤治療；(2)術(shù)中證實(shí)無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，接受標(biāo)準(zhǔn)的胰腺癌根治術(shù)；(3)術(shù)后病理資料證實(shí)所有切緣為R0或R1切除(R0切除為肉眼和顯微鏡下均未看到腫瘤殘留；R1切除為肉眼未看到腫瘤殘留，但在顯微鏡下能看到腫瘤殘留)；(4)患者臨床及隨訪資料完整。本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)通過(guò)(IRB00006761-M2021030)。

二、GPC1蛋白表達(dá)檢測(cè)及分組

標(biāo)本常規(guī)切片，厚度為4 μm，采用免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測(cè)所有標(biāo)本GPC1蛋白表達(dá)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。兔多克隆GPC1抗體(ab73979)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，工作濃度1∶200。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以胞質(zhì)顆粒狀染色和(或)胞膜染色判讀為GPC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分[5]：陰性或陽(yáng)性細(xì)胞占比<15%為0分；染色呈淡黃色占比>50%，或染色呈黃色占比15%～50%為1分；染色呈黃色、陽(yáng)性細(xì)胞占比>50%，或 染色呈棕黃色、占比15%～50%為2分；染色呈棕黃色、占比>50%為3分。0和1分為低表達(dá)組，2和3分為高表達(dá)組。

三、隨訪

通過(guò)患者術(shù)后就診記錄及電話方式進(jìn)行隨訪。就診記錄包括門(mén)診復(fù)查記錄、急診就診記錄和再次入院記錄。隨訪截止至2020年12月31日。患者總生存期定義為手術(shù)日期至死亡時(shí)間或末次隨訪時(shí)間(月)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存期差異比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用單因素及多因素Cox回歸模型分析評(píng)估影響患者生存期的危險(xiǎn)因素，以風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)及95%置信區(qū)間(95%CI)表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PDAC組織與正常胰腺組織GPC1蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色示腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈細(xì)顆粒狀陽(yáng)性著色和(或)胞膜陽(yáng)性表達(dá)，而癌旁正常胰腺組織均為陰性表達(dá)(圖1)。PDAC組織GPC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=93.407，P=0.000)。125例PDAC組織中38例(30.4%)GPC1蛋白表達(dá)評(píng)分為0分，19例(15.2%)為1分，23例(18.4%)為2分，45例(36.0%)為3分，高表達(dá)率為54.4%(68/125)。

注：GPC1為磷脂酰肌醇蛋白聚糖1圖1 胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)(1A)、胞膜(1B)及侵犯神經(jīng)的腫瘤細(xì)胞(1C)GPC1陽(yáng)性表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×200 ×400)

二、GPC1蛋白表達(dá)與PDAC臨床病理特征的相關(guān)性

PDAC組織GPC1蛋白高表達(dá)與腫瘤部位和T分期均顯著相關(guān)，而與患者性別、年齡、有無(wú)糖尿病和胰腺炎病史、血CA19-9水平、切緣情況、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯及脈管侵犯均無(wú)相關(guān)性(表1)。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌組織GPC1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性[例(%)]

三、GPC1蛋白表達(dá)與PDAC患者總生存期的關(guān)系

Kaplan-Meier法生存分析顯示，PDAC組織GPC1陽(yáng)性表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，GPC1蛋白高表達(dá)組及低表達(dá)組的中位生存期分別為(11.00±0.82)個(gè)月(95%CI9.387～12.613)、(18.00±2.36)個(gè)月(95%CI13.382～22.618)，高表達(dá)組顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析顯示，T分期和GPC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)是影響PDAC患者術(shù)后總生存期的危險(xiǎn)因素(P<0.001，表2)。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析顯示，T分期和GPC1蛋白表達(dá)水平是影響PDAC患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.001，表2)。

表2 125例胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后總生存期的單因素及多因素分析

注：GPC1為磷脂酰肌醇蛋白聚糖1

討 論

近年來(lái)，應(yīng)用患者液體活檢材料，結(jié)合外泌體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和代謝小分子化合物檢測(cè)以尋找PDAC早期診斷標(biāo)志物的研究取得了可喜進(jìn)展[7-9]。血清中GPC1陽(yáng)性的循環(huán)外泌體結(jié)合CA19-9檢測(cè)能夠發(fā)現(xiàn)82%的早期PDAC，并能夠在術(shù)后隨診和患者預(yù)后預(yù)測(cè)方面發(fā)揮作用，受到廣泛的關(guān)注[10]。本研究結(jié)果顯示，PDAC組織中GPC1蛋白表達(dá)升高且GPC1蛋白表達(dá)與腫瘤T分期呈正相關(guān)。PDAC的T分期標(biāo)準(zhǔn)依賴于腫瘤大小(T1～T3)和累及腹腔干、腸系膜上動(dòng)脈和(或)肝總動(dòng)脈(T4)的情況[11-12]，提示GPC1可能參與PDAC的發(fā)生與進(jìn)展，GPC1高表達(dá)的腫瘤生長(zhǎng)更為活躍，侵襲能力更強(qiáng)。此外，GPC1蛋白高表達(dá)與患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與Lu等[13]的研究結(jié)果一致。

GPC1由核心蛋白及糖鏈構(gòu)成，具有胞內(nèi)段和跨膜段結(jié)構(gòu)域。GPC1的功能受到其糖鏈硫酸化程度以及核心蛋白錨著位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的影響[14]。本研究結(jié)果顯示GPC1在PDAC腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜均呈陽(yáng)性表達(dá)，此染色模式可能提示GPC1蛋白處于不同的結(jié)構(gòu)、剪切狀態(tài)和功能階段。在PDAC發(fā)生和進(jìn)展的過(guò)程中，GPC1可能保持了持續(xù)的蛋白合成與分泌，并在以近胞膜的區(qū)域發(fā)揮功能。

PDAC的原發(fā)位置(頭部與體尾部)與臨床預(yù)后之間的關(guān)系尚有爭(zhēng)議。Birnbaum等[15]研究比較了208例胰頭部和41例體尾部樣本的臨床病理學(xué)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，表明PDAC解剖學(xué)位置是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。頭部原發(fā)PDAC患者的2年總生存率高于體尾部PDAC，并分析鑒定出334個(gè)差異表達(dá)基因。頭部組上調(diào)的基因提示細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、髓源性巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞活化和胰腺外分泌功能活躍；體尾部組的免疫原性特征表達(dá)顯著降低，并且上調(diào)基因與腫瘤細(xì)胞的鱗狀分化有關(guān)。另有研究報(bào)道，與胰頭PDAC相比，體尾部PDAC的K-ras和Smad4表現(xiàn)出更豐富的基因?qū)W改變[16-17]，提示發(fā)生在胰頭鉤突部的PDAC與發(fā)生在胰體尾部的PDAC在驅(qū)動(dòng)性分子事件、腫瘤免疫環(huán)境和癌細(xì)胞表型上可能存在本質(zhì)差異。導(dǎo)管上皮可能在不同的微環(huán)境、不同的驅(qū)動(dòng)突變下出現(xiàn)不同的分化和演進(jìn)行為。本研究顯示GPC1表達(dá)與腫瘤部位相關(guān)，胰頭鉤突部GPC1高表達(dá)率為60.6%，體尾部為35.5%，推測(cè)這種表達(dá)差異可能由上述諸多原因?qū)е?。未?lái)需要結(jié)合更多病例及詳細(xì)的分子檢測(cè)數(shù)據(jù)綜合分析加以明確。

本組伴有神經(jīng)侵犯的72例PDAC中，41例GPC1高表達(dá)，占56.9%(41/72)。盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)分析GPC1高表達(dá)與神經(jīng)侵犯無(wú)相關(guān)性，但在上述41例PDAC中能夠觀察到多根神經(jīng)纖維周圍腫瘤細(xì)胞的GPC1呈陽(yáng)性表達(dá)。PDAC的腫瘤微環(huán)境具有促結(jié)締組織增生和高度神經(jīng)支配的現(xiàn)象，神經(jīng)周圍浸潤(rùn)是PDAC的一個(gè)典型組織學(xué)特征。在這個(gè)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞沿著固有的神經(jīng)纖維生長(zhǎng)和遷移，并與不良預(yù)后相關(guān)[18-19]。PDAC主要起源于胰腺外分泌部的導(dǎo)管上皮，其接受大量感覺(jué)和腎上腺素能神經(jīng)支配。與均勻分布于整個(gè)胰腺的腎上腺素能神經(jīng)支配不同，感覺(jué)神經(jīng)支配在胰腺頭部的外分泌部最豐富，而胰頭是多數(shù)PDAC的原發(fā)部位。在轉(zhuǎn)基因小鼠PDAC模型中，使用化學(xué)方法去除感覺(jué)神經(jīng)后發(fā)現(xiàn)，感覺(jué)神經(jīng)缺失可減少癌前病變——胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生，并抑制癌前病變向PDAC的進(jìn)展[18-19]。有大量研究發(fā)現(xiàn)，GPC1作為一種細(xì)胞表面的糖蛋白，能夠與多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子結(jié)合，這種相互作用對(duì)血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生持續(xù)影響[15,20]。在PDAC中，GPC1與神經(jīng)生長(zhǎng)因子是否存在相互作用需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，GPC1蛋白在PDAC腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，GPC1蛋白高表達(dá)與腫瘤T分期及患者總生存期呈顯著相關(guān)性，是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突