杜祖超 李鑫健 張占田 白凱淞 白雪巍

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胰膽外科，哈爾濱 150081；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)肝脾外科教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150081

【提要】 炎癥小體是多蛋白組成的胞質(zhì)復(fù)合體，通過調(diào)控caspase-1介導(dǎo)的促炎因子激活來增強(qiáng)對(duì)病原體或應(yīng)激原的免疫應(yīng)答，其激活失控可導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。目前胰腺損傷與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)的耦聯(lián)機(jī)制仍不明確，而炎癥小體的發(fā)現(xiàn)為SAP病因研究提供了一個(gè)新視角。本文就炎癥小體激活在SAP病程中發(fā)揮的作用及其潛在治療策略進(jìn)行綜述。

SAP是由外分泌胰腺損傷誘發(fā)的局部和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，目前仍缺乏特異性的抗炎治療。近年來由感染或應(yīng)激因素導(dǎo)致的促炎程序性細(xì)胞死亡機(jī)制逐漸被闡明[1]，如壞死性凋亡(pyronecrosis)和焦亡(pyroptosis)[2]，這類受調(diào)控的死亡方式可能既是免疫細(xì)胞控制局部感染的防御途徑，也是SAP早期炎癥反應(yīng)擴(kuò)散的原因[3]。其中由炎癥小體激活半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的主要途徑，caspase-1作為炎癥小體經(jīng)典途徑招募的效應(yīng)蛋白[4]，通過裂解膜穿孔蛋白gasdermin D形成氨基端(N端)和羧基端(C端)結(jié)構(gòu)域，隨后其N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜形成10～20 nm的孔隙[5]，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡并釋放IL-1β、IL-18等炎癥遞質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。以往研究發(fā)現(xiàn)caspase-1主要在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞激活[6]，但近期研究提示腺泡細(xì)胞[7]和胰島細(xì)胞[8]也可能存在炎癥小體激活過程和焦亡現(xiàn)象，電鏡下觀察腺泡細(xì)胞焦亡的形態(tài)特點(diǎn)包括胞質(zhì)腫脹、胞核固縮，最終導(dǎo)致胞膜破裂，大量胞質(zhì)內(nèi)容物溢出[9]。因此，深入探討SAP病程中炎癥小體激活途徑以及由其介導(dǎo)的腺泡損傷和免疫反應(yīng)失衡機(jī)制，有助于找到遏制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。

一、SAP病程中炎癥小體的激活

炎癥小體是一組調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)激活的胞質(zhì)蛋白復(fù)合體，參與其組裝的模式識(shí)別受體包括含核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization, NACHT)樣受體(NLRs)、黑色素瘤缺失-2(absent-in-melanoma-2, AIM2)樣受體(ALRs)和維甲酸誘導(dǎo)基因-I(retinoic acid-inducible gene-I, RIG-I)樣受體(RLRs)等[10]。其中NLRs家族的熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3, NLRP3)炎癥小體在胰腺急、慢性炎癥以及腸黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用[11]，而NLRP6炎癥小體主要參與黏膜免疫，維持腸道微生態(tài)的穩(wěn)定性[12]。盡管功能有所不同，NLRs家族卻有著類似的結(jié)構(gòu)，包括C端的富亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat domain, LRR)結(jié)構(gòu)域、中心的NACHT結(jié)構(gòu)域以及N端招募caspase的結(jié)構(gòu)域。LRR主要負(fù)責(zé)感知上游信號(hào)，激活后的NLRP通過NACHT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行寡聚并通過N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain, PYD)招募接頭蛋白即凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain, ASC)，隨后ASC的caspase激活與募集結(jié)構(gòu)域?qū)ro-caspase-1募集在復(fù)合體內(nèi)，形成完整的炎癥小體[13]。NLRP-ASC-caspase-1復(fù)合體中3種蛋白成分相互調(diào)控，在合適的狀態(tài)下激活免疫反應(yīng)。AIM2炎癥小體最近也被證實(shí)與SAP的無菌性炎癥反應(yīng)和病情嚴(yán)重程度相關(guān)[14]。AIM2炎癥小體主要由N端PYD和C端具有200個(gè)氨基酸重復(fù)序列的造血干擾素誘導(dǎo)核抗原結(jié)構(gòu)域(hematopoietic interferon-inducible nuclear antigens with 200 amino acid repeats, HIN200)組成，HIN200識(shí)別胞質(zhì)雙鏈DNA后由PYD募集ASC介導(dǎo)下游反應(yīng)[15]。

目前研究表明NLRP3炎癥小體激活過程包括合成及效應(yīng)階段，除了病原相關(guān)分子模式以外，胞膜通透性改變和離子流動(dòng)(如Ca2+內(nèi)流、K+外流)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、溶酶體破裂、線粒體損傷、自噬缺陷等細(xì)胞事件以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)、硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)、游離脂肪酸、尿酸等代謝物堆積均與其激活相關(guān)，并且它們之間存在復(fù)雜的交互作用[10]。Hoque等[3]依次敲除小鼠炎癥小體成分caspase-1、ASC、NLRP3以及Toll樣受體TLR9/TLR3、嘌呤受體P2X7，通過與雨蛙素誘導(dǎo)的野生型小鼠對(duì)比，證明SAP早期炎癥反應(yīng)產(chǎn)生及發(fā)展需要NLRP3炎癥小體參與，其中胰腺損傷所釋放的核酸(胞核或線粒體DNA)及ATP作為損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)分別作用于巨噬細(xì)胞的TLR9受體和P2X7受體，參與NLRP3炎癥小體的激活。TLR9激活可作為炎癥小體合成的啟動(dòng)信號(hào)，受到配體刺激的TLR通過MyD88-IRAK-TRAF6通路激活I(lǐng)κB激酶(IκB kinase, IKK)復(fù)合體，進(jìn)而導(dǎo)致IκBα磷酸化解離或降解，胞質(zhì)的NF-κB得以解除抑制向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，促進(jìn)NLRP3和白介素前體合成[16]。炎癥小體組裝及發(fā)揮效應(yīng)所需第二信號(hào)尚無定論，有假說認(rèn)為眾多刺激信號(hào)并未直接與NLRP3結(jié)合，而是通過膜通透性改變介導(dǎo)的跨膜離子流參與其激活過程，其中K+外流作為炎癥小體激活的獨(dú)立觸發(fā)因素近年來逐漸受到重視[17]。Di等[18]證明P2X7在感受DAMP刺激后作為非選擇性陽離子通道介導(dǎo)Ca2+、Na+等內(nèi)流，內(nèi)向電流產(chǎn)生的膜電位差在雙孔結(jié)構(gòu)域內(nèi)向整流鉀通道(TWIK2通道)協(xié)同作用下介導(dǎo)K+外流，胞質(zhì)離子分布改變激活了NLRP3炎癥小體，并且阻斷TWIK2通道，可顯著減輕小鼠巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷。Vyleta等[19]提出應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)的線粒體ROS產(chǎn)生和K+外流等可能通過促進(jìn)翻譯起始2α或延長因子2的磷酸化，抑制核糖體功能，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體。目前多數(shù)激活途徑是依據(jù)感染性動(dòng)物模型提出的，而SAP早期以無菌性炎癥為主，因此炎癥小體在不同病因SAP中的激活過程仍需要進(jìn)一步深入研究。此外，腸道微生物相關(guān)分子模式在炎癥小體激活過程中的作用也是近年來的研究熱點(diǎn)。Li等[20]的實(shí)驗(yàn)證明急性壞死性胰腺炎小鼠的腸道菌群與NLRP3炎癥小體存在交互調(diào)控，AP期間條件致病菌(埃希-志賀菌屬及腸球菌屬等)豐度增加導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活，而NLRP3激活又加重了腸道菌群紊亂和腸黏膜屏障損傷，敲除NLRP3的小鼠菌群失調(diào)及炎癥反應(yīng)明顯減輕。該研究結(jié)果提示腸黏膜NLRP6炎癥小體在SAP腸源性感染中是發(fā)揮協(xié)同還是拮抗作用有待進(jìn)一步研究。

二、炎癥小體對(duì)SAP局部和全身炎癥反應(yīng)的調(diào)控

Hoque等[3]研究表明，SAP中NLRP3炎癥小體激活是多條通路協(xié)同作用的結(jié)果，被配體激活的TLR4、TLR9通過NF-κB通路誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)并同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥因子前體蛋白的合成[16]，在各種應(yīng)激原作用下NLRP3寡聚并進(jìn)入效應(yīng)階段，即募集活化caspase-1并促進(jìn)IL-1β、IL-18、高遷移率族蛋白1 (high-mobility group box-1, HMGB1) 前體的成熟和釋放[21]。在細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等誘導(dǎo)下，由caspase-11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑也參與炎癥小體激活和IL前體活化，但在人體并未得到證實(shí)[22]。生理狀況下的NLRP3炎癥小體激活可促進(jìn)損傷組織的清除及修復(fù)，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，但其功能失調(diào)卻與許多炎癥和代謝性疾病相關(guān)。激活的caspase-1、caspase-11可通過切割活化gasdermin D誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，同時(shí)促進(jìn)炎癥因子釋放到胞外[5]，并且焦亡細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)容物作為DAMP繼續(xù)激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大。此外，有研究表明焦亡的單核巨噬細(xì)胞以微泡形式釋放組織因子[23]，觸發(fā)全身凝血功能異常。

Sendler等[24]通過對(duì)急性壞死性胰腺炎小鼠脾、系膜淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞和體外骨髓來源巨噬細(xì)胞(與雨蛙素刺激腺泡共培養(yǎng))進(jìn)行流式細(xì)胞及轉(zhuǎn)錄組分析，證實(shí)NLRP3炎癥小體在調(diào)控機(jī)體促炎和抗炎反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由此可見，早期胰腺損傷激活的免疫反應(yīng)受到自身限制，M1巨噬細(xì)胞清除壞死腺泡細(xì)胞的同時(shí)激活NLRP3炎癥小體，從而促使炎癥因子成熟和釋放。分泌到胞外的IL-1β促進(jìn)IL-6、TNF-α的促炎作用，而IL-18介導(dǎo)中性粒細(xì)胞成熟和局部浸潤，同時(shí)誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫向Th2/Treg方向轉(zhuǎn)化(缺乏由LPS誘導(dǎo)的IL-12情況下)。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-13進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2方向分化，促使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗炎反應(yīng)及組織纖維化。Schmidt等[25]解釋了SAP急性期的SIRS導(dǎo)致器官功能衰竭，而代償性抗炎反應(yīng)則導(dǎo)致壞死組織感染和膿毒癥，二者可能是平行進(jìn)展的過程，炎癥小體介導(dǎo)的促炎和抗炎反應(yīng)失衡可能與臨床SAP患者兩個(gè)死亡高峰期相關(guān)。但以上結(jié)果是基于SAP提出的，輕癥和中度重癥AP的免疫反應(yīng)譜還需進(jìn)一步闡明，以揭示病程由輕癥向重癥轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

三、基于炎癥小體的治療策略

1．炎癥小體抑制劑：NLRP3復(fù)合體的直接抑制劑包括MCC950、OLT1177、曲尼斯特以及CY-09等[11]，其中以MCC950研究最廣泛，它通過抑制ASC寡聚及復(fù)合體ATP酶活性進(jìn)而阻斷caspase-1活化，抑制IL-1β、IL-18激活，從而減輕對(duì)急性壞死性胰腺炎小鼠的促炎及抗炎反應(yīng)[24]。冬凌草甲素是從中藥冬凌草提取的貝殼杉烯二萜類化合物，通過作用于NLRP3炎癥小體的NACHT結(jié)構(gòu)域阻斷其激活，同時(shí)抑制上游NF-κB通路，在多種炎癥性疾病中顯示出良好效果，是較有潛力的候選藥物[26]。炎癥小體間接抑制劑包括格列本脲、16673-34-0、JC124等，下游caspase-1抑制劑包括小白菊內(nèi)酯、VX-740和VX-765等，針對(duì)底物IL-1β、IL-18的單抗已經(jīng)應(yīng)用于相關(guān)自身免疫疾病治療，其在SAP中的療效有待進(jìn)一步驗(yàn)證[11]。此外，Guarda等[27]的實(shí)驗(yàn)表明Ⅰ型干擾素(type I interferons, IFN-I)通過STAT1轉(zhuǎn)錄因子抑制NLRP3激活，并通過STAT3抑制IL-1前體合成，這為IFN-I應(yīng)用于炎癥小體相關(guān)疾病提供了理論基礎(chǔ)。

2．炎癥小體上游信號(hào)阻斷劑：炎癥小體的上游包括轉(zhuǎn)錄合成所需的第一信號(hào)和組裝活化所需的第二信號(hào)[28]。Greten等[29]通過抑制或敲除IKKβ阻止NF-κB激活，實(shí)驗(yàn)小鼠由內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎癥反而加重，這可能來源于其他通路對(duì)IL-1β的合成代償性增加，提示長時(shí)間抑制NF-κB通路可能會(huì)使IL-1β的激活不依賴于炎癥小體途徑。阻斷NLRP3激活第二信號(hào)的阻斷劑很多，主要包括(1)自噬參與溶酶體對(duì)損傷細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的分解代謝，白藜蘆醇能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)性自噬和維持線粒體穩(wěn)定性來抑制NLRP3激活，并促進(jìn)炎癥小體及其下游蛋白降解[30]。(2)TWIK2通道介導(dǎo)的K+外流是NLRP3激活的獨(dú)立因素，奎寧可特異性阻斷TWIK2通道并減輕巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性損傷[18]；β-羥基丁酸是酮體代謝產(chǎn)物，能通過抑制K+外流及ASC寡聚阻斷NLRP3激活[31]。(3)和厚樸新酚是來源于厚樸的雙酚化合物，其通過抑制線粒體ROS阻斷炎癥小體激活[32]。此外，直接拮抗Toll樣受體也可明顯抑制NLRP3激活，如TLR9拮抗劑IRS954可顯著減輕AP小鼠的胰腺壞死和肺部炎癥[3]，乳酸鹽(如乳酸鈉林格等)可通過乳酸受體GPR81(G-protein-coupled receptor 81)抑制TLR4、TLR9介導(dǎo)的NLRP3激活和炎癥因子釋放[33]。

3．非編碼RNA對(duì)炎癥小體的表達(dá)調(diào)控：微小RNA(microRNA，miRNA)通過靶向信使RNA抑制特定基因表達(dá)。研究表明miR-20b-3p的水平升高能夠抑制TXNIP介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活過程，減輕炎癥反應(yīng)[34]。此外，miR-223可直接結(jié)合NLRP3轉(zhuǎn)錄本3′UTR保守位點(diǎn)抑制其表達(dá)，miR-223缺失的小鼠對(duì)內(nèi)毒素的易感性顯著提高[35]。miR-133a-1則通過抑制線粒體解耦聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)炎癥小體效應(yīng)蛋白caspase-1及IL-1β激活[36]。因此，對(duì)miRNA的調(diào)控可能有助于阻止SAP早期的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

綜上所述，炎癥小體被損傷腺泡細(xì)胞所釋放的DAMP激活，通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-18以及HMGB1參與固有免疫反應(yīng)，并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫向Th2/Treg方向轉(zhuǎn)化。抑制NLRP3炎癥小體激活可有效減輕SAP期間的炎癥反應(yīng)，但過度抑制固有免疫可能會(huì)導(dǎo)致后期感染并發(fā)癥增加。因此，對(duì)于炎癥小體的調(diào)控，應(yīng)避免過猶不及，抑制強(qiáng)烈促炎反應(yīng)帶來的SIRS的同時(shí)，應(yīng)避免代償性抗炎反應(yīng)造成的壞死組織感染，以重新建立免疫系統(tǒng)平衡狀態(tài)為治療目標(biāo)。同時(shí)應(yīng)充分發(fā)揮我國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)優(yōu)勢，為遏止輕中癥AP向重癥轉(zhuǎn)化提供可行方案。進(jìn)一步開發(fā)安全有效的靶向NLRP3抗炎藥物不僅能為SAP患者帶來獲益，也能為炎性腸病等其他免疫相關(guān)疾病長期緩解帶來新希望。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突