楊玉春，魏永祥，魏 鑫，劉有春，王興東，孫 斌，張 舵，劉 成

（1 遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所，營(yíng)口115009）（2 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連分院）

多年生植物具有芽休眠的特性，嚴(yán)格意義上來(lái)講它可以分為3個(gè)階段，即進(jìn)入休眠、內(nèi)休眠和恢復(fù)生長(zhǎng)[1-3]。進(jìn)入休眠是休眠的初級(jí)階段，發(fā)生在內(nèi)休眠之前，通常伴隨季節(jié)轉(zhuǎn)換、溫度降低；內(nèi)休眠又叫真休眠、自然休眠，這種狀態(tài)下即便外界環(huán)境是有利的，芽同樣不能夠恢復(fù)生長(zhǎng)；恢復(fù)生長(zhǎng)是芽萌動(dòng)、萌發(fā)生長(zhǎng)的階段，這一階段芽?jī)?nèi)部生理?xiàng)l件成熟，給予適宜環(huán)境芽即能萌發(fā)[4]。這3個(gè)階段受植物生命節(jié)律嚴(yán)格控制、互相交叉、共同控制著芽的休眠和生長(zhǎng)?；ㄑ渴枪麡?shù)開(kāi)花結(jié)果最為重要的部位，低溫是影響花芽休眠的重要因素之一，一方面低溫可以誘導(dǎo)花芽進(jìn)入休眠，另一方面冷量的累積有利于花芽生理成熟并在合適條件下恢復(fù)生長(zhǎng)[5-6]。如果需冷量不足，植株就不能正常完成自然休眠全過(guò)程，進(jìn)而引起生長(zhǎng)發(fā)育障礙，導(dǎo)致花器官畸形或嚴(yán)重?cái)∮?，影響果?shù)可持續(xù)生產(chǎn)[7]。

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosumL.）屬杜鵑花科越橘屬漿果類(lèi)果樹(shù)，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有增強(qiáng)人體免疫力及保護(hù)視力等功效，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦為第三代水果，是人類(lèi)五大健康水果之一[8-9]。隨著人們生活水平的提高，藍(lán)莓作為一種保健水果需求量迅速擴(kuò)大，栽培面積不斷增加。設(shè)施果樹(shù)栽培是豐富城鄉(xiāng)果籃子、節(jié)約能源、促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的設(shè)施產(chǎn)業(yè)之一[10-11]。藍(lán)莓溫室栽培不僅能夠?qū)崿F(xiàn)反季生產(chǎn)，達(dá)到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的目標(biāo)，還可以延長(zhǎng)藍(lán)莓鮮果供應(yīng)的貨架期，從而達(dá)到滿(mǎn)足消費(fèi)者需求、提高藍(lán)莓市場(chǎng)價(jià)值、增加種植戶(hù)收入的目的。目前我國(guó)藍(lán)莓溫室栽培過(guò)程中極易發(fā)生需冷量不足的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致花芽萌發(fā)不整齊、生長(zhǎng)結(jié)果不良[12-13]。前人雖然針對(duì)藍(lán)莓花芽休眠已進(jìn)行了大量的探索，然而仍有很多問(wèn)題尚不清楚。已知積累相同冷量恢復(fù)正常條件后，需冷量低的藍(lán)莓品種可以很快發(fā)芽，而需冷量高的品種則發(fā)芽晚，那么直接或間接導(dǎo)致花芽恢復(fù)生長(zhǎng)差異的因素是什么？解決這一問(wèn)題可為我們深入研討藍(lán)莓品種間休眠差異的具體機(jī)理奠定生理基礎(chǔ)。

為此，筆者以需冷量低、花芽萌發(fā)早的藍(lán)莓品種‘斯巴坦’和需冷量高、花芽萌發(fā)晚的藍(lán)莓品種‘伯克利’為試驗(yàn)材料（前期篩選獲得），探討了二者在花芽休眠和萌動(dòng)期間抗氧化酶活性以及內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化，以期為今后深入研究藍(lán)莓品種間休眠差異奠定生理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為北高叢藍(lán)莓品種‘斯巴坦’（Spartan）和‘伯克利’（Berkeley），栽培在遼寧省營(yíng)口市鲅魚(yú)圈區(qū)熊岳鎮(zhèn)遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所小漿果研究室試驗(yàn)區(qū)，花芽需冷量分別為912、960 h，樹(shù)齡5 年。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

于2017 年9 月15 日、10 月1 日、10 月20 日和2018 年1 月5 日4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣（9 月15日至10 月20 日藍(lán)莓花芽處于進(jìn)入休眠階段，記為休眠早期，1 月5 日藍(lán)莓花芽剛開(kāi)始萌發(fā)，記為萌動(dòng)期、恢復(fù)生長(zhǎng)階段），選擇生長(zhǎng)良好成熟枝條的頂端芽50個(gè)（含3 次重復(fù)），材料收集后立即液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用NBT 法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用鉬酸銨比色法，藥品購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。內(nèi)源激素包括脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)素（IAA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA），其含量的測(cè)定委托蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。激素測(cè)定方法：稱(chēng)取藍(lán)莓芽組織樣品1.0 g，液氮研磨至15 mL 離心管中，加入10 mL 冷卻甲醇-水-甲酸溶液（80∶19∶1，V/V/V），渦旋2 min，4 ℃提取12 h，浸提液10 000 r/min 離心10 min，吸取1.0 mL 上清液，加入9 mL 水，混勻過(guò)Oasis MCX 固相萃取小柱（3 cc/60 mg，美國(guó)Waters公司），2 mL 純水淋洗，最后用1.0 mL 甲醇洗脫，過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)（e2695 液相系統(tǒng)和Quattro Premier XE 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)）測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作圖，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍(lán)莓花芽休眠期抗氧化酶活性變化

如圖1 所示，‘伯克利’SOD 活性呈先下降后上升的趨勢(shì)，‘斯巴坦’SOD 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在10 月20 日比‘伯克利’高43.0%，差異顯著；‘伯克利’CAT 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，‘斯巴坦’CAT 活性與‘伯克利’變化一致，但總體較平穩(wěn)，在10 月20 日和1 月5 日，分別比‘伯克利’高72.5%和183.8%，差異均顯著。

圖1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期抗氧化酶活性變化

2.2 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍(lán)莓花芽休眠期內(nèi)源ABA、IAA 含量變化

如圖2 所示，‘伯克利’ABA 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，‘斯巴坦’ABA 含量基本呈上升狀態(tài)，且始終維持在較低水平，在10 月1 日和10 月20日，分別比‘伯克利’低43.4%和29.3%，差異均顯著；‘伯克利’IAA 含量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，‘斯巴坦’IAA 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且始終維持在較高水平，在10 月20 日和1 月5 日，分別比‘伯克利’高30.7%和107.1%，差異均顯著。

圖2 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期ABA、IAA 含量變化

2.3 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍(lán)莓花芽休眠期內(nèi)源JA、SA 含量變化

如圖3 所示，‘伯克利’JA 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，‘斯巴坦’JA 含量呈下降狀態(tài)，且與‘伯克利’相比下降較快，特別是在10 月1 日和10 月20 日，分別比‘伯克利’低24.5%和29.8%，差異均顯著；‘伯克利’SA 含量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，‘斯巴坦’SA 含量呈上升狀態(tài)，但2個(gè)品種SA 含量只在9 月15 日時(shí)有顯著差異，其他取樣時(shí)期無(wú)顯著差異。

圖3 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期JA、SA 含量變化

2.4 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍(lán)莓花芽休眠期內(nèi)源激素相關(guān)性及比值分析

如表1 所示，‘斯巴坦’藍(lán)莓花芽IAA 與ABA、SA 均呈顯著正相關(guān)，與JA 呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.749、0.849、-0.700；ABA 與JA 呈負(fù)相關(guān)，但沒(méi)達(dá)到顯著，與SA 呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.651；JA 與SA 呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.606?！死{(lán)莓花芽?jī)?nèi)源激素相關(guān)性較差，僅IAA 與ABA 之間表現(xiàn)出顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.582，其他激素之間無(wú)顯著相關(guān)性。

表1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期內(nèi)源激素相關(guān)性分析

如圖4 所示，‘斯巴坦’ABA/IAA 在整個(gè)花芽休眠期間變化較平穩(wěn)，‘伯克利’ABA/IAA 在10 月1 日、10 月20 日、1 月5 日分別比‘斯巴坦’高1.7、0.8、1.0 倍，差異均顯著；‘斯巴坦’JA/IAA在整個(gè)花芽休眠期間總體呈下降趨勢(shì)，‘伯克利’JA/IAA 在10 月1 日、10 月20 日分別比‘斯巴坦’高0.9、0.8 倍，差異均顯著；‘斯巴坦’JA/SA 在整個(gè)花芽休眠期間總體呈下降趨勢(shì)，‘伯克利’JA/SA在10 月1 日比‘斯巴坦’高0.6 倍，差異顯著；‘斯巴坦’SA/IAA 在整個(gè)花芽休眠期間變化較平穩(wěn)，‘伯克利’SA/IAA 在9 月15 日、1 月5 日分別比‘斯巴坦’高0.8、1.0 倍，差異均顯著。

圖4 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期各內(nèi)源激素之間的比值

3 討論與結(jié)論

植物的芽端分生組織包含一類(lèi)具有多潛能性的干細(xì)胞，它可不斷分裂分化產(chǎn)生新的器官原基[14]。休眠意味著分生組織活性靜止，這是多年生植物面臨外界環(huán)境壓力時(shí)所采取的一種生存策略[15]。研究表明，植物的氧化還原平衡調(diào)節(jié)植物芽端分生組織活性，直接或間接影響芽休眠，這在其他物種中均有過(guò)相關(guān)報(bào)道，比如馬鈴薯、葡萄等[16-19]。SOD 可以催化O2-形成H2O2，CAT 則直接清除H2O2。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在休眠前期‘斯巴坦’藍(lán)莓花芽SOD活性以及萌動(dòng)期CAT 活性均顯著高于‘伯克利’藍(lán)莓，說(shuō)明‘斯巴坦’藍(lán)莓花芽活性氧代謝效率高，可以快速清除活性氧，即可以在早期將O2-轉(zhuǎn)化成H2O2，并在芽恢復(fù)生長(zhǎng)階段通過(guò)CAT 快速清除，避免花芽中活性氧累積。反之，‘伯克利’藍(lán)莓花芽SOD 活性雖整體呈上調(diào)趨勢(shì)，但SOD、CAT 活性均比較低，說(shuō)明‘伯克利’藍(lán)莓花芽活性氧清除能力不足?？梢?jiàn)，抗氧化酶活性高可以及時(shí)清除活性氧是‘斯巴坦’藍(lán)莓芽恢復(fù)生長(zhǎng)快速萌發(fā)的重要因素之一。

植物激素在誘導(dǎo)和維持芽休眠進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在10 月1—20 日‘伯克利’和‘斯巴坦’藍(lán)莓花芽中ABA、IAA 含量均呈上升趨勢(shì)，但‘伯克利’花芽中ABA 含量顯著高于‘斯巴坦’藍(lán)莓，IAA 含量顯著低于‘斯巴坦’藍(lán)莓。通過(guò)分析2種激素的比值，可以看出‘伯克利’藍(lán)莓花芽ABA/IAA 顯著高于‘斯巴坦’。出現(xiàn)這種情況的原因可能是‘伯克利’藍(lán)莓花芽中ABA含量高阻礙了生長(zhǎng)素的流入，以致其IAA 含量低，而對(duì)應(yīng)ABA/IAA 比值高，芽在后期萌發(fā)晚。相反‘斯巴坦’藍(lán)莓花芽中ABA 含量低，有利于促生長(zhǎng)因子IAA 進(jìn)入芽，所以ABA/IAA 比值低，芽在后期萌發(fā)快。因?yàn)?，?dāng)植物進(jìn)入休眠時(shí)ABA 會(huì)誘導(dǎo)胞間連絲閉合阻滯促進(jìn)生長(zhǎng)因子通過(guò)胞間連絲進(jìn)入芽，高水平的ABA 還會(huì)限制機(jī)體內(nèi)細(xì)胞代謝[20-21]，而生長(zhǎng)素是芽恢復(fù)生長(zhǎng)階段促進(jìn)芽生長(zhǎng)的重要因子，生長(zhǎng)素可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、花芽分化[22-23]。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，2個(gè)藍(lán)莓品種中ABA 與IAA 均呈顯著正相關(guān)，其中‘斯巴坦’藍(lán)莓ABA 與IAA 相關(guān)系數(shù)（0.749）更高，‘伯克利’藍(lán)莓中ABA 與IAA 相關(guān)系數(shù)僅為0.582，意味著導(dǎo)致‘伯克利’藍(lán)莓促生長(zhǎng)因子不能有效進(jìn)入芽的阻遏因素除了ABA 可能還存在其他因素。ABA 與IAA 之間具體的調(diào)節(jié)關(guān)系還需要進(jìn)一步研究分析。綜上所述，‘伯克利’藍(lán)莓需冷量高、花芽萌發(fā)晚與花芽中ABA 含量高和IAA 含量低有關(guān)。

水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）在花芽休眠過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要的功能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2個(gè)藍(lán)莓品種花芽休眠期間SA 并沒(méi)有表現(xiàn)出比較明顯的差異，具體原因有待進(jìn)一步分析，但‘斯巴坦’藍(lán)莓JA 降解率和水平均顯著低于‘伯克利’。茉莉酸阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制G2/M 期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂[24]，茉莉酸是脂類(lèi)物質(zhì)的衍生物，有研究表明此類(lèi)物質(zhì)的存在有利于維持芽的休眠[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，‘斯巴坦’藍(lán)莓花芽可以快速地下調(diào)JA 并維持較低的水平，這表明維持低水平的JA 含量有利于細(xì)胞分裂、芽恢復(fù)生長(zhǎng)。

綜上所述，‘伯克利’藍(lán)莓比‘斯巴坦’藍(lán)莓冷量積累多、花芽萌發(fā)晚與不能夠及時(shí)清除活性氧，ABA、JA 含量高，IAA 含量低有關(guān)。