周胃雯, 王雪嬌, 唐小波, 孫少清, 符麗娜, 林先珍

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102)

痛風(fēng)是一種由高尿酸血癥導(dǎo)致的復(fù)雜的代謝性疾病，其特征是關(guān)節(jié)炎癥以及在骨骼、關(guān)節(jié)和軟組織中存在尿酸鈉晶體，痛風(fēng)發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素是血清尿酸(Serum Uric Acid,SUA)水平超過(guò)尿酸生理飽和閾值[1]。在中國(guó)，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，近些年痛風(fēng)的患病率和發(fā)病率有逐步上升的趨勢(shì)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，除了飲食、生活習(xí)慣等因素外，痛風(fēng)的發(fā)病還與遺傳因素密切相關(guān)。在最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)中，發(fā)現(xiàn)了大量與SUA水平升高相關(guān)的易感性位點(diǎn)，大量的多態(tài)性位點(diǎn)被證明是痛風(fēng)的危險(xiǎn)因素[3]。ABCG2是分布在近端腎小管或腸道中的單向分泌尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，其功能異?？蓪?dǎo)致尿酸排泄能力下降，ABCG2是目前研究最為廣泛的與尿酸水平有關(guān)的基因，目前已發(fā)現(xiàn)多種ABCG2突變體與SUA濃度存在關(guān)聯(lián)[4]。ABCG2基因SNP(single nucleotide polymorphism)位點(diǎn)rs3114018是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，有研究表明該位點(diǎn)與痛風(fēng)的發(fā)病有關(guān)[5]。迄今為止，ABCG2基因單核苷酸多態(tài)性在?？谑性l(fā)性痛風(fēng)人群中的研究尚未見報(bào)道。本研究將探討ABCG2基因rs3114018位點(diǎn)與?？谑型达L(fēng)發(fā)病的相關(guān)性，為痛風(fēng)的早期診斷和預(yù)防提供新的遺傳標(biāo)記。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象:選擇2019年1月至2020年6月入院的?？谑性l(fā)性痛風(fēng)患者作為研究對(duì)象，以健康體檢者作為對(duì)照，共368 例，其中痛風(fēng)組177例，健康組191例。所有痛風(fēng)患者符合1977年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡18～78歲。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～78歲；血清尿酸水平正常，男性血清尿酸<416.4 μM，女性血清尿酸<356.9 μM；排除明確診斷痛風(fēng)、惡性腫瘤、嚴(yán)重腎功能不全、全身系統(tǒng)性疾病的患者。在取樣前的12 h，所有研究對(duì)象均禁食、禁水，通過(guò)靜脈采集4 mL外周血，收集于含EDTA的抗凝管中。所有研究對(duì)象均獲得知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì):首先從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/)查詢ABCG2的基因序列，進(jìn)一步查找SNP rs3114018位點(diǎn)所在位置并獲得附近序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物序列：5’-CCTTCAGCCACTGAGGAAAAG-3’；下游引物序列：5’-ACTCTTTCTTGGGTACTTTAGCTCTA-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2血液基因組DNA提取:參考NewBio industry公司的血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。在室溫下溶解血液樣本。吸取200 μL血樣至1.5 mL EP管中，加入20 μL蛋白酶K并混勻。加入200 μL GB緩沖液，顛倒混勻直至溶液變?yōu)槌吻?。加?00 μL無(wú)水乙醇混勻。將溶液加入吸附柱中，12000 rpm，離心30 s，將吸附柱放入收集管中。加入500 μL GD緩沖液，12000 rpm，離心30 s，棄去收集管中液體。采用700 μL漂洗液洗滌吸附柱2次，室溫下晾干。將吸附柱放在EP管中，加入200 μL洗脫液，12000 rpm，離心2 min。采用NanoDrop OneC分光光度計(jì)(賽默飛公司)檢測(cè)DNA樣本OD260、OD280和OD230。保證OD260/OD280在1.8～2.0之間，OD260/OD230>2.0。

1.2.3測(cè)序分析基因多態(tài)性:采用New England Biolalbs公司的高保真DNA聚合酶(Phusion High-Fidelity PCR Kit)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為(上游引物，2 μL；下游引物，2μL； gDNA，10 ng；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，10 μL；ddH2O補(bǔ)齊至20 μL)，反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性 95 ℃，30 s；變性 98℃，3 s；退火 68℃，30 s，延伸 72℃，1 min。35個(gè)循環(huán))。不同的樣本以不同的Barcode引物區(qū)分.采用Qiagen公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物?；旌蠘颖竞?，在Ion Proton/illumina主流測(cè)序平臺(tái)上，對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3生化檢測(cè):采用AU480生化分析儀(Beckman coulter)檢測(cè)研究對(duì)象的血尿酸、尿尿酸、血沉、C-反應(yīng)蛋白、三酰甘油、血膽固醇、尿素氮、肌酐的濃度。另外，測(cè)量血糖、收縮壓、舒張壓等指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1痛風(fēng)組與健康組臨床資料比較:痛風(fēng)患者平均病程為(6.3±7.5)年，21.2%的患者有痛風(fēng)石。痛風(fēng)患者高嘌呤飲食比例、BMI、尿酸、血糖、血肌酐、白細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶均顯著高于健康組(P<0.05)，而年齡、性別、肌酐清除率、三酰甘油和總膽固醇等因素在兩組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 痛風(fēng)組與健康組臨床資料比較

2.2ABCG2基因rs3114018基因型檢測(cè)和等位基因頻率分布:采用Logistic回歸法分析，比較健康組和痛風(fēng)組基因型和分布頻率，結(jié)果見表2。痛風(fēng)組177例，其中AC型62例，攜帶頻率為35.02%，健康組191例，其中AC型21例，攜帶頻率為10.99%；在痛風(fēng)組中，CC型63例，攜帶頻率為35.59%，在健康組中，CC型42例，攜帶頻率為21.98%。痛風(fēng)組AA、AC、CC等位基因頻率與正常人群相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)?？傮w樣本基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，P>0.05，表明樣本具有群體代表性。

表2 痛風(fēng)組基因攜帶頻率與健康組的比較n(%)

2.3ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)發(fā)作特點(diǎn)的相關(guān)性:在125例ABCG2基因突變型(AC和CC)痛風(fēng)患者中，表現(xiàn)出了發(fā)病年齡更早、累計(jì)關(guān)節(jié)數(shù)目更多、痛風(fēng)石發(fā)生概率高、年發(fā)作次數(shù)更頻繁的特點(diǎn)。其中，與AA基因型患者相比，突變患者中發(fā)病年齡≤20歲、累計(jì)受累關(guān)節(jié)數(shù)和痛風(fēng)石發(fā)生概率這3項(xiàng)指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表3。

表3 ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)發(fā)作特點(diǎn)的相關(guān)性

2.4ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)患者生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián):我們采用單因素方差分析ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)各項(xiàng)生化指標(biāo)的相關(guān)性，包括血尿酸、血糖、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶。結(jié)果見表4，在痛風(fēng)患者中，AC和CC基因型攜帶者顯著高于AA型攜帶者(P<0.05)，提示ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與糖尿病、心臟病、肝腎功能損害發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

表4 ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與生化指標(biāo)的相關(guān)性

2.5ABCG2基因rs3114018基因型與痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)性分析:為了進(jìn)一步分析ABCG2基因rs3114018基因型與?？谑腥巳和达L(fēng)發(fā)病的相關(guān)性，我們采用Logistic回歸法分析OR值，校正因子為高嘌呤飲食、BMI、尿酸、血糖、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶。結(jié)果見表5，與AA基因型相比，AC攜帶者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了3.273倍(95%CI:1.861～12.326，P = 0.001)，校正后為2.642倍(95%CI:1.598～13.117，P = 0.002)，CC攜帶者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了3.825倍(95%CI:1.935～13.114，P = 0.003)，校正后為3.281倍(95%CI:1.896～13.771，P = 0.001)。以上結(jié)果表明，AC和CC基因型均是痛風(fēng)易感基因型，與海口市痛風(fēng)的發(fā)病密切相關(guān)。

表5 rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)

3 討 論

痛風(fēng)是一種常見的慢性關(guān)節(jié)炎。在中國(guó)，痛風(fēng)的發(fā)病率因地區(qū)而異，發(fā)病率在0.09%～1.14%之間[6]。高尿酸血癥是發(fā)生痛風(fēng)最重要的危險(xiǎn)因素[7]。研究表明，遺傳在個(gè)體間SUA濃度差異中起著重要作用，除了環(huán)境因素外，大約60%的差異歸因于遺傳[8]。ABCG2是目前研究最為廣泛的SUA相關(guān)的基因，研究證實(shí)，ABCG2基因多態(tài)性與痛風(fēng)發(fā)病有密切聯(lián)系[9]。目前研究比較廣泛的痛風(fēng)的易感位點(diǎn)是rs72552713和rs2231142。SNP rs3114018是近些年新發(fā)現(xiàn)的與痛風(fēng)有關(guān)的ABCG2基因多態(tài)性位點(diǎn)。ABCG2 作為痛風(fēng)的易感性的危險(xiǎn)基因，在國(guó)內(nèi)具有種族和地域差異[10]。夏燕等人研究表明，SNP rs3114018與武陵山地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病相關(guān)[11]。但該位點(diǎn)在海口市痛風(fēng)人群中的研究，尚未見報(bào)道。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，rs3114018多態(tài)性與?？谑型达L(fēng)發(fā)病相關(guān)，痛風(fēng)患者AC和CC型攜帶頻率顯著高于健康組(P<0.05)。部分患者表現(xiàn)出發(fā)病年齡早，發(fā)作次數(shù)頻繁，累及關(guān)節(jié)數(shù)目多、痛風(fēng)石等臨床特征，其中發(fā)病年齡≤20歲、累計(jì)受累關(guān)節(jié)數(shù)和痛風(fēng)石發(fā)生概率這3項(xiàng)指標(biāo)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。另外，ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與血尿酸、血糖、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶有顯著的相關(guān)性(P<0.05)，提示該位點(diǎn)與糖尿病、心臟病、肝腎功能損害發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析的結(jié)果表明，與AA基因型相比，AC攜帶者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了3.273倍，CC攜帶者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了3.825倍。調(diào)整了痛風(fēng)組與健康組中血尿酸、血糖、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等差異因素之后，AC基因型(OR=2.642，95%CI:1.598～13.117，P = 0.002)和CC基因型(OR=3.281，95%CI:1.896～13.771，P = 0.001)基因型與痛風(fēng)仍具有顯著的相關(guān)性。

綜上所述， ABCG2基因rs3114018的多態(tài)性?？谑性l(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病存在顯著的相關(guān)性，是痛風(fēng)發(fā)病的危險(xiǎn)因素，有望成為?？谑腥巳哼M(jìn)行痛風(fēng)篩查的一個(gè)重要的遺傳標(biāo)記物。然而，本研究?jī)H通過(guò)臨床樣本和數(shù)據(jù)分析，得出rs3114018與?？谑型达L(fēng)發(fā)病存在相關(guān)性這一結(jié)論，但具體機(jī)制仍不不清楚；另外，本研究納入的痛風(fēng)患者病例數(shù)仍較少，后期還需要擴(kuò)大臨床樣本量，以證實(shí)本研究的結(jié)論。