陳 煦， 陸定貴

(1.廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院病理科， 廣西 百色 533000 2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科， 廣西 百色 533000)

乳腺癌是目前危害女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，近年來(lái)我國(guó)乳腺癌患者數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)，且癌細(xì)胞擴(kuò)展迅速，不及時(shí)治療會(huì)危及患者生命。臨床早期篩查能夠快速確診是否為乳腺癌，進(jìn)而為患者治療爭(zhēng)取時(shí)間[1,2]。目前基因?qū)W檢測(cè)技術(shù)是乳腺癌篩查的常用方法，Her-2基因檢測(cè)是乳腺癌診斷的關(guān)鍵，染色體17q12-21.32是Her-2基因的分布位點(diǎn)，在基因序列調(diào)控下，生成絡(luò)氨酸激酶受體，此受體具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，在受體作用下異源、同源二聚體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)通路被激活，促使腫瘤生長(zhǎng)、癌細(xì)胞擴(kuò)散[3]。Her-2基因監(jiān)測(cè)不僅能診斷癌癥，還能對(duì)臨床治療效果進(jìn)行評(píng)估，可見(jiàn)其用途之廣。在Her-2檢驗(yàn)中，免疫組化(IHC)、熒光原位雜交(FISH)是兩種常用方法，前者在癌癥初篩中比較適用，優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、操作便捷，但檢測(cè)準(zhǔn)確性上有一定缺陷，在必要情況下需輔助FISH檢測(cè)[4]。本研究旨在探析上述兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性及差異性，詳細(xì)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料:以98例乳腺癌患者的手術(shù)病理切片為檢測(cè)對(duì)象，切片收集時(shí)間：2017年8月至2019年8月。提供手術(shù)切除標(biāo)本的患者年齡范圍30～80歲，平均(51.05±1.50)歲。所有患者的手術(shù)切片均經(jīng)過(guò)病理檢驗(yàn)確定為乳腺癌，其中浸潤(rùn)性小葉癌、導(dǎo)管癌分別50例、48例。所有標(biāo)本均采用甲醛(中性)固定，并進(jìn)行石蠟包埋。

1.2試劑與方法

1.2.1試劑:PV-6000免疫組化試劑盒，由北京欣興唐生物科技有限公司提供；抗人Her-2單克隆抗體，由北京同立海源生物科技有限公司提供。Her-2DNA探針試劑盒、熒光顯微鏡等試驗(yàn)所需設(shè)備，清點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)施后進(jìn)行矯正，準(zhǔn)備試驗(yàn)。

1.2.2FISH檢測(cè):準(zhǔn)備甲醛(10%)適量，將切片組織置于甲醛液中，靜置24h固定，作4m切片，置于65℃溫度下烘烤后靜置一晚；準(zhǔn)備二甲苯，進(jìn)行脫蠟反應(yīng)，直至水化，然后在不同濃度乙醇中依次脫水(100%、85%、70%)，準(zhǔn)備去離子水，將脫水后的二甲苯置于其中浸泡3min；準(zhǔn)備酸性亞硫酸鈉(30%)進(jìn)行，在50℃下浸泡切片半h，進(jìn)行2次洗片操作，將切片置于蛋白酶K溶液中浸泡20min，溫度維持37℃；再次進(jìn)行洗片，將切片放入準(zhǔn)備好的HCL(0.1moL/L)溶液中，靜置10min；制成玻片，在-20℃下預(yù)冷，并在不同濃度乙醇中依次作脫水處理，將丙酮在室溫下進(jìn)入到玻片中，然后晾干；將玻片加熱至56℃，進(jìn)行封邊處理；標(biāo)本投入雜交儀，變性處理5min(73℃)，然后維持恒溫37℃過(guò)夜，次日洗片，晾干。暗室中用熒光顯微鏡觀察玻片。

1.2.3IHC檢測(cè):將病理組織做成石蠟切片，切下4m，準(zhǔn)備二甲苯將石蠟水化，持續(xù)進(jìn)行2min的高壓熱修復(fù)；準(zhǔn)備PBS沖洗液，連續(xù)進(jìn)行3次沖洗，在恒溫37℃下進(jìn)行一抗孵育，時(shí)間為1h；再次在PBS溶液中沖洗3次，每次2min；準(zhǔn)備PV-6000溶液，將切片置于其中孵育20min，保持37℃恒溫。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1FISH結(jié)果判定：隨機(jī)觀察一個(gè)癌細(xì)胞，記錄其中30個(gè)隨機(jī)的雙色熒光信號(hào)，得到橘紅色/綠色比值，比值在1.8以下記為陰性，見(jiàn)圖1;比值超過(guò)2.2記為陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。若在1.8～2.2間，需重新計(jì)數(shù)并判定。

圖1 癌細(xì)胞雙色熒光信號(hào)陰性

圖2 癌細(xì)胞雙色熒光信號(hào)陽(yáng)性

1.3.2IHC結(jié)果判定：根據(jù)切片染色程度對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，無(wú)染色或輕微染色為-,見(jiàn)圖3;細(xì)胞染色超過(guò)10%但不足中度染色，記為+，見(jiàn)圖4;達(dá)到中度染色記為++，見(jiàn)圖5；呈棕黃色為+++，見(jiàn)圖6。

圖3 無(wú)染色或輕微染色

圖4 細(xì)胞染色超過(guò)10%但不足中度染色

圖5 達(dá)到中度染色

圖6 呈棕黃色

2 結(jié) 果

2.1C-erbB-2蛋白、Her-2基因檢測(cè)結(jié)果分析:IHC檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性占53例(54.08%)，陰性占45例(45.92%)。FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性占比29例(29.59%)，陰性占69例(70.41%)。以FISH為金標(biāo)準(zhǔn)，IHC檢測(cè)為-的符合率為42(93.33%)，+的符合率5(17.86%)，++的符合率11(78.57%)，+++的符合率10(90.91%)。見(jiàn)表1。

表1 C-erbB-2蛋白 Her-2基因檢測(cè)結(jié)果分析n(%)

2.230-50歲患者檢測(cè)結(jié)果分析:IHC檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性占29例(58.00%)，陰性占21例(42.00%)。FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性占比16例(32.00%)，陰性占34例(68.00%)。以FISH為金標(biāo)準(zhǔn)，IHC檢測(cè)為-的符合率為19(90.48%)，+的符合率4(23.53%)，++的符合率4(66.67%)，+++的符合率5(83.33%)。見(jiàn)表2。

表2 30～50歲患者檢測(cè)結(jié)果分析n(%)

2.350歲以上患者檢測(cè)結(jié)果分析:IHC檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性占23例(47.92%)，陰性占25例(52.08%)。FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性占比12例(25.00%)，陰性占36例(75.00%)。以FISH為金標(biāo)準(zhǔn)，IHC檢測(cè)為-的符合率為24(96.00%)，+的符合率1(10.00%)，++的符合率7(77.78%)，+++的符合率4(100.00%)。(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 50歲以上患者檢測(cè)結(jié)果分析n(%)

3 討 論

Her-2基因是人體17號(hào)染色體上的原癌基因，隨著臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Her-2基因與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、化療、預(yù)后等都存在緊密關(guān)系[5]。在相關(guān)報(bào)道中指出，三苯氧胺內(nèi)分泌療法、CMF化療等方案治療乳腺癌(Her-2基因擴(kuò)增導(dǎo)致)，效果不甚明顯，且機(jī)體呈現(xiàn)出不同程度的抗藥性[6]。對(duì)此，有學(xué)者提出在系統(tǒng)化療后，給予患者表柔比星、多西他賽等藥物，能夠有效控制患者病情，此外蒽環(huán)類藥物在Her-2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者中有較高敏感性，研究顯示此類藥物用于乳腺癌治療能夠有效延長(zhǎng)生存率[7]。

無(wú)論何種藥物治療乳腺癌，都需要精準(zhǔn)的檢測(cè)方法以確定是否為乳腺癌患者，早期精確診斷能為患者治療爭(zhēng)取時(shí)間，避免癌癥發(fā)展到晚期措施治療時(shí)機(jī)。Her-2基因是目前臨床上檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的重要方法，IHC、FISH作為效果較為確切的檢測(cè)方法，臨床上使用較多，本次研究也對(duì)兩種方法進(jìn)行比較。

IHC主要是對(duì)Her-2受體蛋白檢測(cè)的一種方法，癌細(xì)胞表面的Her-2特異性抗體能被IHC檢測(cè)識(shí)別出來(lái)，進(jìn)而分析蛋白的表達(dá)情況。與FISH檢測(cè)相比，此法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，部分材料能夠重復(fù)使用，因此臨床檢測(cè)中常用到IHC。本研究顯示，以FISH為金標(biāo)準(zhǔn)，所有患者病理切片IHC檢測(cè)為-的符合率為42(93.33%)，+++的符合率10(90.91%)；30-50歲患者IHC檢測(cè)為-的符合率為19(90.48%)，+++的符合率5(83.33%)；50歲以上患者IHC檢測(cè)為-的符合率為24(96.00%)，+++的符合率4(100.00%)。分析上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IHC檢測(cè)C-erbB-2蛋白中，陰性(-)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)具有較高的檢出率與符合率，尤其是50歲以上患者+++檢出率為100%，因此臨床檢測(cè)中推薦將無(wú)明顯癥狀、或癥狀嚴(yán)重患者用IHC檢測(cè)。但此方法以Her-2基因的受體蛋白為檢測(cè)對(duì)象，若標(biāo)本處理操作不規(guī)范，易破壞蛋白質(zhì)原有結(jié)構(gòu)，加之主觀因素影響，檢測(cè)結(jié)果存在較大偏差。蛋白質(zhì)檢測(cè)方法畢竟未追溯到癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的根源，與之相比基因檢測(cè)可信度較高。此外，不同年齡段患者IHC檢測(cè)符合率也有差異，本研究顯示50歲以上患者IHC檢測(cè)符合率要高于30～50歲的患者。

由此本研究提出FISH檢測(cè)，其原理為：探針被熒光染料標(biāo)記，進(jìn)而將目標(biāo)核酸片段、探針雜交，從而得到擴(kuò)增基因序列，通過(guò)染色辨別是否患有乳腺癌。FISH檢測(cè)技術(shù)能夠保證病理組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，通過(guò)染色能準(zhǔn)確識(shí)別Her-2基因擴(kuò)增序列，有效排除其它癌細(xì)胞對(duì)檢測(cè)的干擾，因此FISH是業(yè)界公認(rèn)的檢測(cè)Her-2基因的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。與IHC檢測(cè)相比，F(xiàn)ISH具有明顯的優(yōu)越性：癌病病灶組織中，DNA穩(wěn)定性較高，在切片組織包埋、脫水、染色等處理過(guò)程中不易受到破壞，且在處理期間樣本敏感性較低；此法能夠通過(guò)擴(kuò)增基因序列，客觀判定陰性、陽(yáng)性。本次采用雙色熒光信號(hào)來(lái)鑒別陰陽(yáng)性，探針與目標(biāo)基因片段雜交后，置于熒光顯微鏡下，能顯示出兩種顏色的熒光點(diǎn)，Her-2基因片段用橙色熒光染色，剩下片段用綠色熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察到橙色熒光增多，結(jié)果記為陽(yáng)性[9]。本研究結(jié)果顯示，以FISH為金標(biāo)準(zhǔn)，所有患者IHC檢測(cè)+符合率5(17.86%)，++符合率11(78.57%)，30～50歲患者+符合率4(23.53%)，++符合率4(66.67%)，50歲以上患者+符合率1(10.00%)，++符合率7(77.78%)，反之FISH在++、+++患者中的檢出率較高。由此可見(jiàn)，F(xiàn)ISH在檢測(cè)Her-2擴(kuò)增基因方面具有較高的可靠性。

綜上所述，IHC初步篩查C-erbB-2蛋白，-、+++符合率較高，在++、+篩查中IHC符合率較低，建議在IHC篩查基礎(chǔ)上再做FISH篩查，以明確HER-2基因狀態(tài)。