周 梅,劉秋月,狄 冉,胡文萍,王翔宇,張效生,張金龍,儲(chǔ)明星?

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,豬分子數(shù)量遺傳學(xué)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥230001;3天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津300381)

產(chǎn)羔數(shù)是綿羊最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一,據(jù)報(bào)道,它對(duì)綿羊繁殖力遺傳進(jìn)展的經(jīng)濟(jì)效益貢獻(xiàn)率為74%—96%,因此,尋找與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因一直是遺傳育種研究者關(guān)注的重點(diǎn)[1-3]。

GLIS1來(lái)源于轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族Kruppel樣鋅指蛋白,是一種在小鼠卵母細(xì)胞和受精卵一、二細(xì)胞期高表達(dá)的蛋白,在小鼠胚胎發(fā)育中的表達(dá)具有時(shí)空性[4]。GLIS1同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制活性,能夠?qū)ε咛グl(fā)育的特定階段進(jìn)行調(diào)控,對(duì)于小鼠的胚胎發(fā)育尤為重要,同時(shí)Gli蛋白的表達(dá)或活性又受其上下游BMP和Wnt蛋白家族的成員調(diào)控[5]。Takahashi等[6]報(bào)道,在體外培養(yǎng)條件下GLIS1基因在卵母細(xì)胞以及胚胎發(fā)育不同階段的細(xì)胞中表達(dá),且在牛胚胎發(fā)育過(guò)程中十分關(guān)鍵。王小海等[7]研究發(fā)現(xiàn),GLIS1基因在小鼠的胚胎發(fā)育以及成纖維細(xì)胞的重編程過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。胚胎發(fā)育成功與否對(duì)動(dòng)物的的生殖力會(huì)產(chǎn)生直接影響,因此對(duì)影響胚胎發(fā)育過(guò)程的重要因子進(jìn)行研究很有必要。

前期,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)中國(guó)9個(gè)地方綿羊品種(分為單羔組和多羔組)共89只綿羊開(kāi)展了全基因組重測(cè)序[8],篩選到綿羊產(chǎn)羔數(shù)候選基因GLIS1及相關(guān)多態(tài)位點(diǎn)。鑒于GLIS1在哺乳動(dòng)物生殖中的作用還未見(jiàn)報(bào)道,本研究對(duì)該基因兩個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G在不同綿羊群體中的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),并與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以探討GLIS1基因與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間是否存在某種內(nèi)在聯(lián)系,以期為綿羊高效育種提供充分的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共包含760只綿羊,具體信息如表1所示。

表1 綿羊樣本具體信息Table 1 Specific information of sheep sample

1.2 SNP位點(diǎn)檢測(cè)

由北京君諾德生物技術(shù)有限公司采用Sequenom MassARRAY?SNP技術(shù)[9]對(duì)GLIS1基因兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G在不同產(chǎn)羔數(shù)的綿羊品種中進(jìn)行基因型檢測(cè)。分型樣品為DNA(樣本量20μL,樣品質(zhì)量濃度為40—80 ng∕μL)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)GLIS1兩個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性與小尾寒羊各胎次產(chǎn)羔數(shù)分別進(jìn)行差異顯著性分析,采用比較均值和一般線性模型單因素方差分析中的最小顯著差異(Least significant difference,LSD)法進(jìn)行分析。使用的相關(guān)性分析模型與寸靜宇[10]和文禹粱[11]論文中報(bào)道的一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLIS1基因多態(tài)性分析

通過(guò)分型發(fā)現(xiàn),GLIS1基因2個(gè)SNP位點(diǎn)在分型的綿羊品種中共存在3種基因型,g.27775611 T＞C位點(diǎn)3種基因型分別是TT、CT和CC,g.27857114 T＞G位點(diǎn)分別是TT、GT和GG(圖1)。

圖1 GLIS1基因分型Fig.1 Genotyping of GLIS1 gene

根據(jù)分型結(jié)果,對(duì)2個(gè)SNP位點(diǎn)在單、多羔品種中的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并用卡方檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證單、多羔綿羊品種間的基因型頻率和等位基因頻率之間的差異。

由表2可知,在不同產(chǎn)羔能力的2個(gè)綿羊品種之間,GLIS1基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G位點(diǎn)在兩個(gè)綿羊品種中的優(yōu)勢(shì)等位基因分別為T(mén)和G。

表2 GLIS1基因SNP位點(diǎn)在2個(gè)綿羊品種中等位基因和基因型頻率分析Table 2 Analysis of allele and genotype frequencies of SNPs at GLIS1 gene in two sheep breeds

對(duì)2個(gè)SNP位點(diǎn)在6個(gè)綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并計(jì)算該位點(diǎn)在各群體中的多肽信息含量(反映某個(gè)等位基因在群體中受選擇的強(qiáng)度,其值大小與受選擇強(qiáng)度成正比)、雜合度和有效等位基因數(shù),并用卡方檢驗(yàn)該位點(diǎn)在各群體中的平衡狀態(tài)。從表3可知,GLIS1基因g.27775611 T＞C位點(diǎn)在灘羊、薩?？搜蚝筒菰筒匮蜻@三個(gè)群體中呈中度多態(tài)(0.25≤PIC＜0.5),在小尾寒羊、蘇尼特羊和杜泊羊3個(gè)群體中均呈低度多態(tài)(PIC＜0.25);g.27857114 T＞G位點(diǎn)在薩?？搜蚝投挪囱?個(gè)群體中呈中度多態(tài)(0.25≤PIC＜0.5),在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和草原型藏羊4個(gè)群體中均為低度多態(tài)(PIC＜0.25)。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明,除了杜泊羊的g.27775611 T＞C位點(diǎn)以及草原型藏羊的g.27857114 T＞G位點(diǎn)外,其余位點(diǎn)在各品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P＞0.05)。

表3 GLIS1基因SNP位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)分析Table 3 Population genetic analysis of SNPs at GLIS1 gene

2.2 GLIS1基因多態(tài)位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

將2個(gè)SNP位點(diǎn)分別與小尾寒羊3個(gè)胎次的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果見(jiàn)表4。GLIS1基因g.27775611 T＞C位點(diǎn)突變顯著影響小尾寒羊第二胎產(chǎn)羔數(shù)(P＜0.05),但對(duì)第一胎和第三胎產(chǎn)羔數(shù)無(wú)明顯影響(P＞0.05),但總體而言,CC型產(chǎn)羔數(shù)最多,TT型其次,CT型最少;g.27857114 T＞G位點(diǎn)與各胎產(chǎn)羔數(shù)之間均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。

表4 GLIS1基因2個(gè)SNP位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析Table 4 Analysis between the two SNP loci of GLIS1 gene and litter size in Small Tail Han Sheep

3 討論與結(jié)論

綿羊在我國(guó)家畜中占據(jù)重要地位,是三大家畜之一,但絕大多數(shù)綿羊產(chǎn)羔數(shù)低的特點(diǎn)成為我國(guó)綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素[12]。因此,如何適當(dāng)提高綿羊每胎的產(chǎn)羔數(shù)是養(yǎng)羊業(yè)亟待解決的科學(xué)難題。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,高產(chǎn)羔數(shù)主效基因分子標(biāo)記在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用可能是解決其產(chǎn)羔數(shù)低的有效方法。目前科學(xué)家已經(jīng)定位了一些與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的主效基因,其中最為著名的是BMPR1B[13-15]、BMP15[16-17]、GDF9[18-19]和B4GALNT2[20]。然而綿羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀是一個(gè)受微效多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀,僅僅靠已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)羔數(shù)主效基因分子標(biāo)記很難在整體上提高綿羊的產(chǎn)羔數(shù),繼續(xù)挖掘與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的基因仍十分必要。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)GLIS1基因在單、多羔綿羊之間FST值達(dá)到了顯著水平,雖然目前尚無(wú)GLIS1基因與動(dòng)物繁殖性能之間關(guān)系的相關(guān)報(bào)道,但已有其在小鼠胚胎發(fā)育中的相關(guān)報(bào)道[5],而胚胎發(fā)育也是影響動(dòng)物最終生殖力的重要階段。因此,本研究首次對(duì)候選基因GLIS1多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行研究,旨在探討其多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系,從而尋找與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因及關(guān)鍵位點(diǎn)。

通過(guò)對(duì)GLIS1基因2個(gè)SNP位點(diǎn)g.27775611 T＞C和g.27857114 T＞G進(jìn)行分型分析發(fā)現(xiàn),在不同產(chǎn)羔能力的兩個(gè)綿羊品種之間,GLIS1基因2個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01),表明這2個(gè)SNP位點(diǎn)很可能與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。群體遺傳學(xué)分析表明,g.27775611 T＞C位點(diǎn)在灘羊、薩?？搜蚝筒菰筒匮蛑惺艿街械葟?qiáng)度選擇(0.25≤PIC＜0.5),g.27857114 T＞G位點(diǎn)在薩?？搜蚝投挪囱蛑惺艿街械葟?qiáng)度選擇,2個(gè)位點(diǎn)在其他綿羊品種中受到選擇的強(qiáng)度很低(PIC＜0.25),該結(jié)果表明不同位點(diǎn)在不同的綿羊品種中會(huì)受到不同強(qiáng)度的選擇,不過(guò)以上結(jié)果可能與某個(gè)綿羊品種遺傳多樣性較低有關(guān),另外,本試驗(yàn)中有的品種樣本量較少可能也對(duì)結(jié)果有一定程度的影響。哈代溫伯格平衡分析結(jié)果表明,在長(zhǎng)期的進(jìn)化和選擇下,兩個(gè)位點(diǎn)在遺傳適應(yīng)性上可能具備一定的優(yōu)勢(shì)。杜泊羊的g.27775611 T＞C位點(diǎn)和草原型藏羊的g.27857114 T＞G位點(diǎn)均沒(méi)有任何突變型,小尾寒羊和灘羊的g.27857114 T＞G位點(diǎn)存在少數(shù)突變雜合個(gè)體,但均無(wú)突變純合個(gè)體,可能是因?yàn)榧兒贤蛔冃蛡€(gè)體在胚胎發(fā)育過(guò)程中就死亡了,而突變雜合型的生存力可能相比野生型也削弱了很多,因此存在的個(gè)體很少。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,GLIS1基因的g.27775611 T＞C位點(diǎn)突變純合子在各胎次中產(chǎn)羔數(shù)最高,突變雜合子在各胎次中產(chǎn)羔數(shù)最低且低于突變純合子,且在第二胎中達(dá)到了差異顯著水平,但由于突變純合子在所選群體中個(gè)體較少,不具有很強(qiáng)的說(shuō)服力,有待于增加樣本量進(jìn)一步研究。g.27857114 T＞G位點(diǎn)沒(méi)有野生型個(gè)體且突變雜合型個(gè)體很少,說(shuō)明該位點(diǎn)突變純合增加了個(gè)體的適應(yīng)性,但該位點(diǎn)突變是否增加了產(chǎn)羔數(shù),因沒(méi)有野生純合個(gè)體所以無(wú)法得知。突變純合子在第二胎和第三胎中產(chǎn)羔數(shù)均最高,但與突變雜合子之間未達(dá)到差異顯著水平,初步推測(cè)g.27857114 T＞G位點(diǎn)雖然對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)有一定影響,但可能并不是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)鍵位點(diǎn)。

本研究初步得出以下結(jié)論:GLIS1基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)g.27775611 T＞C(蘇氨酸→丙氨酸)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān),可能參與綿羊生殖調(diào)控;而錯(cuò)義突變位點(diǎn)g.27857114 T＞G(蘇氨酸→脯氨酸)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。