孔婉瑩 李旭 洪瑜 胡云龍

眾所周知，人類一切疾病的根源都是因為自由基，自由基會影響細胞的活性，嚴重的還會殺滅細胞，因此，要想保證人體健康，就必須要清除自由基，而抗氧化物則可以有效地解決這一問題?？寡趸锿ㄟ^清除體內(nèi)的自由基，同時減少組織氧化，以此來達到保護機體的最終目的。天然的抗氧化物相較于合成物而言，有著更好的應用效果，其副作用小，同時能夠降低免疫系統(tǒng)活性的干擾，因而有著更好的促氧化效果。

高原鏈帶藻是從我國西藏那曲青龍鄉(xiāng)普保巴村巴木錯湖分離得到的，經(jīng)過初步的實驗研究發(fā)現(xiàn)，高原鏈帶藻在常溫常壓的條件下進行培養(yǎng)，其在培養(yǎng)基中生長6d之后，藻類細胞中的蛋白質(zhì)含量達到了71.68%，同時對蛋白粗提取物進行測試后發(fā)現(xiàn)，其蛋白具有一定的抗氧化性，能夠有效地對氫氧根離子以及DPPH自由基進行清除，且清除能力較強。本文中主要針對高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化及結構鑒定進行分析，利用柱層析方法進行高原連帶藻蛋白的分離純化，并結合質(zhì)譜技術進行蛋白結構的測試，以此來對高原鏈帶藻抗氧化蛋白進行更為深入的檢測研究。

一、材料與方法分析

1.高原鏈帶藻的培養(yǎng)及蛋白粗提取。在進行高原鏈帶藻的培養(yǎng)過程中，首先在500mL的搖瓶中加入250mL的BG11培養(yǎng)液，進行接種時其濃度為1×106個/mL，同時培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光照條件為108μmol/（㎡·s），光暗周期則為12L。在該培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6天后進行抽濾操作，收集所需要的高原鏈帶藻細胞，將之進行冷凍處理，備用。

在進行高原鏈帶藻抗氧化蛋白的粗提取時，首先需要取凍干的微藻細胞粉末50mg放入研缽中，在冰水浴的條件下進行研磨，取其上清液，利用緩沖溶液定容，最后加入硫酸銨直到其飽和度的80%，攪拌均勻后待用。靜置30min之后，收集蛋白沉淀并用磷酸緩沖液進行再次溶解，再經(jīng)過后續(xù)一系列的操作后便完成了蛋白的粗提取。

2.高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化。進行抗氧化蛋白的分離純化時，需要使用到AKTA Prime蛋白純化系統(tǒng)進行操作。在此過程中，首先將蛋白的濃縮液濃度調(diào)節(jié)為20mg/mL，并在填料柱上樣1mL，使用氯化鈉溶液溶于磷酸緩沖液進行梯度洗脫，控制好洗脫的流速，由此來收集各峰的組分。收集到各個部分的組分之后，需要使用磷酸緩沖溶液進行再次溶解，將蛋白的濃度控制在8mg/mL，再用1mol/L的氯化鈉和氫氧化鈉溶液分別沖洗，由此便將所得到的抗氧化蛋白進行了再次的分離純化，所得到的最終產(chǎn)品也更為純凈。

3.高原鏈帶藻結構的鑒定分析。進行高原鏈帶藻抗氧化蛋白結構的鑒定分析時，首先需要將10μg純化后的抗氧化蛋白用50mmol/L的TEAB緩沖溶液復溶，之后加入0.2μg的混合酶液，在37℃的條件下進行酶解，6h之后將產(chǎn)物多肽進行低溫真空干燥，并使用乙腈溶液進行復溶，產(chǎn)物進行二級質(zhì)譜分析，即利用相關軟件對質(zhì)譜圖所對應的多肽段序列進行分析。在一級結構的基礎上還可以使用Phyre2在線程序進行高級結構的模擬分析。

二、結果與分析

1.高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化。高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化都是在4℃的條件下進行的，經(jīng)過離子交換柱的分離之后，得到了3個主要的蛋白峰，且洗脫體積為22-77mL時洗脫液顯示了抗氧化活力。在此過程中，抗氧化蛋白也得到了較好的分離，其總質(zhì)量為5.7mg。

2.抗氧化蛋白處理對于細胞MDA水平和SOD、CAT活力的影響。實驗結果顯示，氧化脅迫能夠促使產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)MDA，由此便破壞了細胞膜的完整性，同時也會導致SOD和CAT失活，這三方面的指標都能在一定程度上反映出細胞受到自由基攻擊的程度，經(jīng)過過氧化氫處理后的細胞中，MDA、SOD以及CAT的含量都有所變化，其具體的影響如表1所示。

3.高原鏈帶藻抗氧化蛋白結構。通過質(zhì)譜分析可知，高原鏈帶藻抗氧化蛋白主要是由408個氨基氨基酸按照一定序列所組成的，且經(jīng)過ExPasy在線程序的分析顯示，其蛋白質(zhì)分子量為44.8kD。

本文中對于高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化及結構鑒定進行了分析探討，由此對于高原鏈帶藻有了更為深入的認識。