陳貴娥 唐天樂(lè) 唐源 董明芝 劉鐵明 梅其炳 孫陽(yáng)△

(1.中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)海軍第一醫(yī)院藥劑科，廣東 湛江 524005；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室， 國(guó)家中藥胃腸藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710032；3.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710032)

胃潰瘍是消化性潰瘍中最常見(jiàn)的類型，胃黏膜上皮的完整性、黏膜細(xì)胞更新、表皮生長(zhǎng)因子、黏液-碳酸氧鹽屏障、黏膜血流、前列腺素等因素構(gòu)成了黏膜的防御屏障[1-3]。幽門螺桿菌感染、應(yīng)激、藥物等是導(dǎo)致潰瘍的攻擊因子與保護(hù)胃黏膜的防御因子失衡的主要因素，是胃潰瘍發(fā)生的主要原因[4-8]。中醫(yī)藥在防治胃潰瘍方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，艽龍膠囊是首個(gè)從天然植物秦艽中提取出來(lái)的以龍膽苦苷為主要成份的純中藥制劑。本品具有清肝瀉熱之功效，用于治療功能性消化不良屬肝胃郁熱證者，癥見(jiàn)胃脘飽脹，脘部燒灼，口干口苦等。本研究通過(guò)建立無(wú)水乙醇誘發(fā)大鼠急性胃潰瘍模型，探討艽龍膠囊對(duì)胃潰瘍的預(yù)防作用，為該產(chǎn)品的臨床應(yīng)用與深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 阿司匹林，廠家：沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：170602。分析純酒精(安徽安特食品股份有限公司，批號(hào)：1610073301 )； 試劑盒： MPO試劑盒，南京建成生物工程研究所，規(guī)格：100管/48樣，批號(hào)：20171007；SOD試劑盒，南京建成生物工程研究所，規(guī)格：100管/96樣，批號(hào)：20171026。肝糖原試劑盒，南京金益柏生物科技有限公司，規(guī)格：100管/48樣，批號(hào)：JEB-13992。儀器設(shè)備：電子天平(ME204，METTLER公司)；光學(xué)顯微鏡(Nikon H600L，日本Nikon公司)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5418R，德國(guó)Eppendorf公司)；實(shí)驗(yàn)病理系統(tǒng)(HM34E，德國(guó)Ieiss公司)；酶標(biāo)儀(Imark，美國(guó)伯樂(lè))。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雌雄各半，體重200～225 g。購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(軍)2012-0007。單籠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)，濕度40%～50%，溫度(22±2℃)。顆粒飼料 (空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) 喂養(yǎng)，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，造模實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)禁食。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 (1)動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)性大鼠急性胃潰瘍模型的復(fù)制：分組：SD大鼠60只，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)3d，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、雷尼替丁對(duì)照組、艽龍膠囊高、中、低3個(gè)劑量組。模型復(fù)制：采用乙醇 + 阿司匹林法，復(fù)制大鼠胃潰瘍模型[9,10,11]。給藥前禁食不禁水12 h，首日給藥前先灌胃無(wú)水乙醇1 ml/200g，1h后再灌胃阿司匹林200 mg/kg，此后每日1 次，連續(xù)給藥4 d，復(fù)制胃潰瘍模型。(2)給藥治療:劑量設(shè)置依據(jù)：艽龍膠囊的臨床劑量為每次2粒，1日3次，規(guī)格為0.08g/粒，故60 kg成人為0.48g/日，約8 mg/kg，折算到大鼠劑量約為50 mg/kg，作為中劑量，設(shè)高劑量100 mg/kg，低劑量為25 mg/kg。給藥：從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，空白對(duì)照

組和模型對(duì)照組給予蒸餾水，10 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)7d；艽龍膠囊+模型3個(gè)劑量組分別按100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg給藥，每日1次，連續(xù)7d。陽(yáng)性對(duì)照藥雷尼替丁(30 mg/kg)給藥，每日1次，連續(xù)7d。(3)一般情況觀察：動(dòng)物生長(zhǎng)狀況、糞便性狀、被毛色澤、自主活動(dòng)、行為活動(dòng)，體重每日一次。(4)潰瘍面積測(cè)定：末次給藥后禁食12 h，用乙醚麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈采血處死動(dòng)物，取胃，沿胃大彎側(cè)剪開(kāi)鼠胃，用冰冷的生理鹽水洗滌胃體，在冰冷的紙上黏膜向上鋪平，按Guth[8]法計(jì)算：損傷長(zhǎng)度≤1 mm( 包括糜爛點(diǎn)) 為1分；1 mm < 損傷≤2 mm 為2 分；2 mm < 損傷≤3 mm 為3 分；3 mm< 損傷≤4 mm 為4 分；損傷> 4 mm 為5 分；損傷寬度> 2 mm 者分值加倍，所有得分相加為潰瘍指數(shù)。取潰瘍及邊緣部分約0.5 cm2，用10%福爾馬林固定胃組織，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。其余部分刮取粘膜，液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80℃保存，待測(cè)MPO和SOD活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)測(cè)定結(jié)果行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況：正常組大鼠活潑，色澤光滑，主動(dòng)飲食，飲食正常，大便濕潤(rùn)，呈橢圓形或條索狀。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除正常對(duì)照組以外其余各組均在造模第3d開(kāi)始出現(xiàn)體重減輕或增長(zhǎng)緩慢，毛發(fā)不光滑，蓬松，精神萎靡，活動(dòng)減少，喜歡群集。艽龍膠囊大劑量組(100 mg/kg)對(duì)大鼠體重與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，大鼠體重明顯改善。上述結(jié)果可見(jiàn)，艽龍膠囊能改善酒精引起的胃潰瘍大鼠一般情況，包括行為活動(dòng)、體重。見(jiàn)表1、表2。

表1 艽龍膠囊對(duì)酒精引起的胃潰瘍大鼠(雌)體重的影響

表2 艽龍膠囊對(duì)酒精引起的胃潰瘍大鼠(雄)體重的影響

2.2胃粘膜潰瘍指數(shù) 按Guth[3]法計(jì)算潰瘍指數(shù)，圖1可見(jiàn)，空白對(duì)照組小鼠胃粘膜呈現(xiàn)正常肉色，粘膜皺襞光滑，未見(jiàn)出血點(diǎn)；模型組可見(jiàn)彌散性出血點(diǎn)，胃部粘膜出現(xiàn)充血、水腫、出血及糜爛點(diǎn)；艽龍膠囊各組均可抑制潰瘍形成。經(jīng)胃潰瘍指數(shù)分

析，結(jié)果顯示，模型組大鼠胃粘膜潰瘍指數(shù)明顯增高；與模型組相比較，艽龍膠囊低、中、高劑量組和雷尼替丁組大鼠胃粘膜潰瘍指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，隨著劑量的增加，其作用效果更為顯著。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 艽龍膠囊對(duì)酒精引起的大鼠胃潰瘍的影響

表3 艽龍膠囊對(duì)酒精引起的大鼠胃潰瘍的影響

2.3胃黏膜MPO和SOD的水平 胃粘膜MPO

和SOD水平測(cè)定結(jié)果顯示，模型組大鼠粘膜組織中MPO明顯升高，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)，艽龍膠囊50、100 mg/kg劑量組胃粘膜組織中MPO水平較模型組、雷尼替丁明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠胃粘膜組織中SOD表達(dá)明顯降低，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)，艽龍膠囊50 mg/kg、100 mg/kg劑量組胃粘膜組織中SOD表達(dá)較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)，雷尼替丁組與艽龍膠囊100 mg/kg劑量組比較，SOD表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。見(jiàn)表4。

表4 艽龍膠囊對(duì)酒精引起的胃潰瘍大鼠胃粘膜組織MPO、SOD水平的影響

2.4病理組織學(xué)檢查 胃組織做HE病理檢測(cè)，正常組大鼠胃粘膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯病理改變，無(wú)充血水腫。模型組粘膜上皮見(jiàn)局灶性脫落，見(jiàn)充血水腫，粘膜腺體萎縮，腺體呈囊狀擴(kuò)張，同時(shí)粘膜固有層、粘膜肌層變薄且肌層紊亂、下緣缺損。艽龍膠囊對(duì)胃潰瘍大鼠胃病理?yè)p傷程度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，艽龍膠囊大、中劑量給藥組能明顯減輕胃潰瘍大鼠的胃黏膜損傷程度，并具有明顯的量效關(guān)系。見(jiàn)圖2。

注：A:正常組；B：模型組；C：雷尼替丁組；D：艽龍大劑量組；E：艽龍中劑量組；F：艽龍小劑量組。圖2 艽龍膠囊對(duì)酒精引起的胃潰瘍大鼠胃粘膜HE病理形態(tài)觀察(×100)

3 討 論

乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型制備方法可靠、周期短、損傷機(jī)制明確，有利于研究藥物對(duì)胃潰瘍防治機(jī)制的研究[12-14]。本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)水乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型結(jié)果顯示：肉眼觀察模型組大鼠胃黏膜可見(jiàn)散在出血點(diǎn)、條索樣出血帶和點(diǎn)狀潰瘍面鏡下觀察可見(jiàn)胃黏膜組織破損、不完整、伴出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。這表明胃潰瘍大鼠模型復(fù)制成功。

從中藥及天然藥物中尋找療效確切、成分單一、易于觀察的有效活性成分是防治胃潰瘍的有效途徑之一。本實(shí)驗(yàn)以酒精聯(lián)合阿司匹林方法成功復(fù)制大鼠胃潰瘍模型，表現(xiàn)為大鼠胃肉眼可見(jiàn)潰瘍，粘膜組織中MPO水平的升高和SOD水平的降低，胃粘膜組織病理形態(tài)學(xué)改變。MPO是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的過(guò)氧化物酶，其數(shù)值能夠提示中性粒細(xì)胞的數(shù)目與中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，也可反應(yīng)炎癥損傷的程度[15]。SOD，是胃粘膜的保護(hù)因子之一，能夠抑制胃部的壁細(xì)胞通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生大量ATP 和ROS，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用[16]。給予艽龍膠囊25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg治療7d后，觀察到：艽龍膠囊給藥50 mg/kg、100 mg/kg劑量組大鼠體重較正常組大鼠體重下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；艽龍膠囊各劑量組大鼠胃粘膜潰瘍指數(shù)較模型組比較有顯著意義(P<0.01)，胃潰瘍程度有明顯的改善。與雷尼替丁組比較，艽龍膠囊100 mg/kg劑量組對(duì)大鼠胃潰瘍程度改善無(wú)顯著差異；胃粘膜組織MPO和SOD水平結(jié)果顯示：艽龍膠囊使胃潰瘍大鼠粘膜組織中MPO表達(dá)較模型組降低，SOD表達(dá)水平達(dá)較模型組升高； HE結(jié)果顯示艽龍膠囊100 mg/kg劑量組明顯改善大鼠胃粘膜組織病理形態(tài)。此外，本實(shí)驗(yàn)采用雌性和雄性不同性別大鼠為研究對(duì)象，是為探討大鼠胃潰瘍模型及給藥治療是否存在性別差異。我們的結(jié)果表明，雌性和雄性各組在模型復(fù)制和給藥治療效果方面均無(wú)顯著差異，提示，艽龍膠囊治療大鼠胃粘膜損傷的作用與性別因素?zé)o顯著相關(guān)性。

綜上所述，預(yù)防應(yīng)用艽龍膠囊可減輕無(wú)水乙醇聯(lián)合阿司匹林誘導(dǎo)的胃黏膜損傷，同時(shí)可以改善胃黏膜中壁粘膜組織中MPO及SOD表達(dá)水平，抑制粘膜損傷。