陸艷榮 張鑫 呂茵 張瑾熔 王海峰

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸腹放療科，烏魯木齊 830011)

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1-3]，放射治療是不能手術(shù)的中晚期食管癌最主要的治療手段[4]，但放射治療的效果并不令人滿意，張安度等[5]報道采用三維適形放療技術(shù)食管癌放療的5年生存率也只有24.5%，而楊民生等[6]早年報道單純放療局部未控或復發(fā)率高達68.6%，說明局部未控或復發(fā)仍然是放療失敗的首要原因。為進一步提高食管癌放療局部控制率，迫切需要確定食管癌放療抵抗的內(nèi)在分子機制并依此開發(fā)新的治療方法。survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proreins，IAPs)家族最小的成員，其主要功能為抑制凋亡及調(diào)節(jié)細胞周期。其具有在胚胎及胎兒組織及大部分惡性腫瘤組織中高表達，在成年人正常成熟組織中不表達的獨特表達方式[7]。文獻研究表明其在食管癌組織亦為高表達[8]，下調(diào)其表達可增加食管癌放射敏感性[9]，是食管癌理想的治療靶點。Egr1基因?qū)儆诩纯淘缙诨蚣易?immediate early genes，IEGs)的成員，其啟動子含有輻射感應組件，使其能被放射線所誘導而表達增高。利用這個特點，有學者提出了將Egr1基因的啟動子序列與需要表達的基因序列連接，用電離輻射驅(qū)動Egr1基因的啟動子帶動目的基因高表達的基因-放射治療理論[10]?；谝陨涎芯?，我們利用的Egr1基因啟動子，構(gòu)建Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管癌食管鱗癌KYSE150細胞，并聯(lián)合放療，靶向下調(diào)survivin表達，來研究此種方法相比于survivin抑制劑YM155聯(lián)合放療，是否會進一步促進食管癌細胞凋亡，增加食管癌細胞的放射敏感性，以此探索與放療聯(lián)合增加食管癌局控率的新方法。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 細胞株：KYSE150細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA質(zhì)粒由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司合成。細胞培養(yǎng)于RPMI-1640+10%胎牛血清+1%雙抗的培養(yǎng)基中。LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)，Trizol(Aidlab)，HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、50×ROX Reference Dye2、SYBR Green Master Mix(VAZYME)，Taq Plus DNA Polymerase(TIANGEN)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物)，兔多抗survivin(武漢三鷹生物)，兔多抗Caspase3(北京博奧森生物)，兔單抗Caspase9(CST)，HRP標記羊抗小鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物)，ECL底物液(Thermo)，X光膠片(柯達)，顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)，APC/7-AAD細胞凋亡試劑盒(三箭生物)。

1.2實驗方法 (1)細胞分組處理：食管鱗癌KYSE150細胞按照處理方式分為①空白對照組：不加任何處理+放療，②空載體對照組：轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒+放療，③Egr1-survivin shRNA組，轉(zhuǎn)染pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA質(zhì)粒+放療，④YM155組，YM155處理+放療。每組設置3個復孔。轉(zhuǎn)染用LipofectamineTM2 000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作步驟依照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。測定食管癌KYSE150細胞YM155的IC50值為5 nM。向加入細胞培養(yǎng)的6孔板加入YM155溶液，調(diào)節(jié)YM155的終濃度為5 nM。轉(zhuǎn)染及YM155處理48 h后進行細胞照射，照射方法為：6MV-X 射線進行室溫垂直照射，劑量率200 cGy/min，10 cm×10 cm照射野，100 cm源皮距，照射劑量單次4 Gy，照射后24 h收獲細胞進行各項檢測。(2)qPCR檢測各處理組細胞survivin mRNA水平:利用Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA的純度和濃度后，取1 ug按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。合成的cDNA做10倍稀釋，進行qPCR檢測。qPCR反應體系：cDNA 4 ul，F(xiàn)orward Primer (10 uM)0.4 ul，Reverse Primer (10 uM)0.4 ul，SYBR Green Master Mix 10 ul，50×ROX Reference Dye2 0.4 ul，ddH2O 4.8 ul；反應條件：50 °C 2 min，95 °C 10 min；95 °C 30 sec ，60 °C 30 sec，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。survivin引物序列：F: 5‘-CCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCT-3’，R: 5‘-CTCGTTCTCAGTGGGGCAGTGGATG-3’。GAPDH引物序列：F: 5‘-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3’，R: 5‘-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3’。(3)Western Blot檢測各處理組細胞survivin、Caspase3及Caspase9蛋白水平：向按分組處理好的細胞加入RIPA裂解液，于冰上充分裂解后收集上清至預冷EP管中，于4 ℃下12 000 rpm離心5 min。取上清用BCA法測定蛋白濃度。后將提取的蛋白充分變性，調(diào)整每個樣品蛋白上樣量為40 ug，進行SPS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后在0 ℃恒流條件下電轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：survivin 200 mA，50 min；Caspase3 200mA，70min；GAPDH、Caspase9 200mA，90min。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉、洗膜后，進行抗體雜交，經(jīng)一抗、二抗孵育后X光顯影，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值進行分析。(4)流式細胞儀檢測各處理組細胞凋亡：將按不同分組處理后細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，0.25%胰酶消化細胞，12 00 rpm，5 min離心，分別收集各處理組細胞。細胞凋亡檢測：加PBS洗滌2次，按照APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行：A. 加入500 uL Binding Buffer，重懸細胞；B. 5 uL 7-AAD混勻后加入5 uL APC，混勻；C. 室溫避光反應5～15 min，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1各處理組細胞survivin mRNA的表達結(jié)果 從表1、圖1的qPCR檢測結(jié)果可見，Egr1-survivin shRNA+放療組KYSE150細胞survivin mRNA的表達量明顯低于單純放療的空白對照組和空載體對照組，亦低于YM155+放療組。與3個對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 KYSE150細胞各處理組survivin mRNA 表達結(jié)果

注：1.空白對照組，2.空載體對照組，3.Egr1-survivin shRNA組，4.YM155組。圖1 KYSE150細胞各處理組survivin mRNA表達結(jié)果

2.2各處理組細胞survivin蛋白、Caspase3及Caspase9裂解碎片的表達結(jié)果 從表2、圖2、3的Western-Blot檢測結(jié)果可見，Egr1-survivin shRNA+放療組KYSE150細胞survivin蛋白的表達量明顯低于單純放療的空白對照組和空載體對照組及YM155+放療組，與3個對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Caspase3及Caspase9裂解碎片檢測量明顯高于三個對照組，與3個對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 各處理組KYSE150細胞survivin蛋白、Caspase3、 Caspase9裂解碎片表達量

注：1：空白對照組，2：空載體對照組，3：Egr1-survivin shRNA組，4：YM155組圖2 各處理組KYSE150細胞survivin蛋白、Caspase3、 Caspase9裂解碎片表達結(jié)果

注：1：空白對照組，2：空載體對照組，3：Egr1-survivin shRNA組，4：YM155組圖3 各處理組KYSE150細胞survivin蛋白、 Caspase3、Caspase9裂解碎片表達結(jié)果

2.3流式細胞儀檢測KYSE150細胞各處理組凋亡的結(jié)果 從表3細胞凋亡檢測結(jié)果可見，Egr1-survivin shRNA組及YM155組凋亡率均明顯高于空白對照組和空載體對照組，Egr1-survivin shRNA組與YM155組相比凋亡率也明顯增加，Egr1-survivin shRNA組與其他三組的細胞凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 KYSE150細胞各處理組凋亡檢測結(jié)果

3 討 論

食管癌我國是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率為常見惡性腫瘤第6位[11]。一直以來放療都是食管癌的主要根治方法之一，但放療的療效并不令人滿意。據(jù)祝淑釵等[12]對500例中晚期食管癌的療效分析顯示，全組 1 、3、5 年生存率分別為 71.1%、32.6 %、20.8%。即便是經(jīng)過嚴謹統(tǒng)計設計的NEOCRTEC5010研究，其結(jié)果顯示對于潛在可切除的胸段食管鱗癌，術(shù)前同步放化療組的pCR率為43.2%，OS為100.1月，雖較以前的治療模式有明顯提高[13]，但與其他常見惡性腫瘤的療效相比，食管癌放療的生存期仍不能令人滿意，急需探索新的治療靶點和治療理念。

survivin蛋白與食管癌的發(fā)生及進展密切相關(guān)，Dabrowski等[14]研究顯示survivin在食管鱗癌標本中表達明顯升高，其陽性率可達83.33%，而且文獻顯示其過表達與患者較差的預后相關(guān)[15]。Egr1基因啟動子區(qū)含有CArG盒/CC(A+T-rich)GG區(qū)的特殊結(jié)構(gòu)，使Egr1基因能被放射線所誘導而表達增高。利用這一特點，我們以survivin做為治療的靶點，利用可被電離輻射誘導的Egr1基因啟動子，構(gòu)建Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管鱗癌KYSE150細胞后用X射線照射，測定細胞內(nèi)survivin的mRNA表達和蛋白水平的變化情況，來觀察Egr1-survivin shRNA聯(lián)合放療下調(diào)survivin表達后對KYSE150細胞凋亡的影響，以確定這種干預否會進一步增加食管癌細胞的放射敏感性，促進食管癌細胞死亡。

通過siRNA方法可下調(diào)survivin的表達是一種常用的干擾survivin表達的方法，文獻報道證實了這種方法的可靠性，這種處理的結(jié)果為促進癌細胞凋亡，增加癌細胞對放療的敏感性[16]。我們的研究通過增加survivin shRNA的表達來抑制survivin表達，其結(jié)果顯示Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染后經(jīng)放療誘導，KYSE150細胞survivin mRNA及蛋白的表達水平均較對照組明顯下調(diào)，證實Egr1-survivin shRNA質(zhì)粒合成是成功的，經(jīng)放射線誘導后起到了預期的效果，Egr1啟動子確實帶動了合成質(zhì)粒中位于其下游的survivin shRNA表達增加，并進而降低了survivin mRNA及蛋白的表達。YM155是一種靶向survivin的小分子藥物，其可以在mRNA及蛋白水平強烈抑制survivin的表達[17]。實驗研究顯示其可增加人非小細胞肺癌細胞對于γ射線的敏感性，與單純照射相比，其與γ射線聯(lián)合可明顯增加癌細胞放射敏感性，促進裸鼠非小細胞肺癌移植瘤的縮小[18]。本研究也顯示YM155+放療處理處理后，KYSE150細胞survivin mRNA及蛋白的表達水平較空白對照組及空載體組均明顯下調(diào)，顯示出與文獻報道相一致的survivin基因的表達抑制作用，可作為本研究的適宜陽性對照。雖然有以上多種靶向survivin研究探索，但現(xiàn)有的無論siRNA還是以YM155為代表的小分子抑制劑，都存在一定的缺陷，未能真正應用于臨床[19]。故此我們希望通過基因-放射治療的理念來探索靶向survivin新治療思路。

本研究將Egr1基因的啟動子與survivin shRNA連接構(gòu)建重組質(zhì)粒并聯(lián)合放療，這種方法的優(yōu)勢在于，既可發(fā)揮放療局部殺傷腫瘤細胞的作用，又可通過放療誘導survivin shRNA表達增加，從而起到比siRNA方法更強的促進食管癌細胞凋亡的作用。其研究結(jié)果顯示，Egr1-survivin shRNA+放療處理后，KYSE150細胞survivin mRNA及蛋白的表達水平明顯下調(diào)，與凋亡相關(guān)的Caspase3、Caspase9蛋白碎片的檢出量明顯增加，說明內(nèi)源性及外源性通路的凋亡均增強；并通過流式細胞術(shù)檢測到了此處理組細胞凋亡率明顯的增高，表明Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染+放療可通過抑制survivin表達、增加細胞凋亡的途徑，明顯增加食管癌細胞的放射敏感性。

本研究結(jié)果表明Egr1-survivin shRNA+放療對于survivin表達的抑制在所有處理組中是最強的，相較于單純放療、YM155處理+放療，可更大程度地降低survivin的表達。且經(jīng)Egr1-survivin shRNA轉(zhuǎn)染降低survivin達后聯(lián)合放療，其促凋亡作用也強于YM155+放療處理，證實此種方法相比于YM155處理，對于食管鱗癌細胞具有更強的放射增敏作用。由此可得出：Egr1-survivin shRNA聯(lián)合放療可進一步增加食管鱗癌細胞放療敏感性，是一種有前景的食管癌治療基因-放療思路，值得進一步研究。因本實驗為細胞學研究，其得出的結(jié)論還有待于動物實驗及人體的臨床試驗進一步證實。