李飛 安妮妮 彭金普 陳輝 范霞

(貴州省人民醫(yī)院小兒外科，貴州 貴陽 550002)

尿道下裂(hypospadias)是兒童最常見的先天性泌尿生殖畸形之一，發(fā)病率為1/200～1/300，且呈逐年上升的趨勢[1]。尿道下裂是一種尿道開口位置異常的男性先天畸形，尿道口分布在正常尿道口至?xí)幉康倪B線上，多數(shù)病人伴有陰莖彎曲，患兒不能站立排尿，對成年后的性功能及生育能力有顯著影響，嚴重危害患兒的身心健康，給家庭和社會帶來嚴重影響[2]。迄今為止，手術(shù)矯形仍是治療本病的唯一措施，然而，300多種術(shù)式無一例外均伴有明顯的術(shù)后并發(fā)癥，如尿瘺，尿道狹窄，手術(shù)瘢痕等，最終造成“尿道下裂殘廢”[3]。因此，深入研究尿道下裂的發(fā)生機制并尋求其防治手段是重要的研究方向。尿道下裂的發(fā)生原因多且復(fù)雜，就目前而言，能明確病因的病例不足5%[4]。其中，遺傳因素、內(nèi)分泌因素和環(huán)境因素與之密切相關(guān)[5]。非那雄胺，是一種四氮雜甾體化合物,可抑制睪酮轉(zhuǎn)化成雙氫睪酮，對雄激素受體沒有親和力，更為重要的是，它不影響其他的激素的水平，如促卵泡素,促黃體激素、皮質(zhì)激素、雌二醇、催乳素和甲狀腺素等[5]，能更好的模擬尿道下裂的發(fā)生。因此，在本研究中，我們首次采用非那雄胺構(gòu)建尿道下裂的SD雄鼠模型，探索尿道下裂的發(fā)生機制。報告如下。

1 材料和方法

1.1實驗材料 SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，約6周齡，體重150g左右，購于南通大學(xué)實驗動物中心(許可證號SCXK(蘇)2014-0001)，動物飼養(yǎng)房間的室溫22～25℃，濕度50%左右，晝夜周期為12/12 h，自由飲食和攝水。

1.2實驗方法 (1)非那雄胺暴露動物模型構(gòu)建：SD大鼠正常飼養(yǎng)至其成年，體重250g左右，將其按雄雌比例1:1于下午4點合籠，次日上午10點檢查雌鼠有無陰栓，有陰栓者計為妊娠第0.5天(GD0.5)。將孕鼠隨機分為4組：正常對照組、非那雄胺低劑量組(10 mg/kg.bw)、非那雄胺中劑量組(50 mg/kg.bw)和非那雄胺高劑量組(100 mg/kg.bw)。每組12只，于GD8～GD16每天上午8點灌胃。非那雄胺溶于生理鹽水中。其中10只孕鼠于GD18上午8點剖腹取出胎鼠，2只孕鼠自然分娩，待子代雄鼠生長至30 d觀察陰莖外觀。(2)觀察胎鼠尿道下裂畸形：正常雄性SD大鼠尿道開口于陰莖頂端，包皮完整。尿道開口于陰莖與會陰的交接處或陰莖體腹側(cè)，伴有包皮分裂為判定尿道下裂雄性大鼠的標準。(3)陰莖組織病理學(xué)觀察：陰莖組織置于4%多聚甲醛中固定48 h左右，隨后脫水、包埋。組織包埋機沿著陰莖橫切面進行石蠟包埋后切片，厚度為4 μm，放入60oC烤箱中過夜。石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后，浸泡于蘇木素染液中約2 min，采用1%酸乙醇分化3 s，隨后用自來水沖洗2 min以復(fù)藍。飽和碳酸鋰溶液中5 s，自來水沖洗1 min。置于伊紅染液中5 s，自來水沖洗3 min。隨后切片依次放入50%、70%、85%、95%、100%、100%酒精、二甲苯、二甲苯各2 min，中性樹脂封片。待其充分晾干后，在光學(xué)顯微鏡下觀察陰莖的組織病理學(xué)改變。(4)尿道板成纖維細胞的原代培養(yǎng)：SD孕鼠于GD18斷頸處死，剖腹取出胎鼠，在解剖顯微鏡下觀察性腺，以找到睪丸為準選出雄性胎鼠。無菌條件下取出胎鼠尿道組織，轉(zhuǎn)移至超凈臺，用含青鏈霉素的PBS沖洗組織5遍。刮去尿道周圍的組織內(nèi)膜，用眼科剪將組織塊剪成2 mm×2 mm 大小。將組織塊貼到培養(yǎng)瓶中，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。待其完全貼壁后，加入5 mL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液。待細胞長滿至85%時，移去組織塊，用PBS清洗兩次，隨后用0.25%胰蛋白酶消化細胞2 min，傳代。(5)尿道板成纖維細胞的鑒定：4%多聚甲醛固定細胞爬片15 min， 0.5% Triton X-100(PBS配制)對細胞進行穿孔，室溫放置15 min。5% BSA室溫封閉1 h；加入vimentin抗體(ABCAM,ab11256)，4℃過夜。PBS清洗3次，10 min/次。室溫孵育熒光二抗1 h(Roche,11684817910)。DAPI孵育30 min，隨后用PBS清洗3次，10 min/次。用蒸餾水洗去殘留的PBS，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡采集圖像。(6)CCK8檢測細胞增殖：將處于對數(shù)生長期的成纖維細胞用0.25%胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)板對消化后的細胞進行計數(shù)，將細胞接種于含有96孔板中，2×104個細胞/孔/100 μL培養(yǎng)基。待細胞長滿約80%時，更換無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h使細胞同步化。按照實驗分組，每組設(shè)6個復(fù)孔。每孔加入10 μL CCK8溶液，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h。酶標儀檢測吸光度，450 nm，記錄吸光度值。計算細胞增殖程度：細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100 。(7)檢測細胞凋亡：Western blot檢測尿道板成纖維細胞中凋亡蛋白caspase 3和p53的蛋白表達情況，采用Image J軟件測定顯色條帶灰度值，目的蛋白/ GAPDH，從而得到目的蛋白的相對表達量。將陰莖組織進行石蠟切片后，利用免疫組化檢測凋亡蛋caspase 3和p53的蛋白表達。將細胞爬片用4%多聚甲醛固定15 min， 0.5% Triton X-100(PBS配制)對細胞進行穿孔，室溫放置15 min。5% BSA室溫封閉1 h；加入caspase 3(ABCAM,ab13847)和p53抗體(ABCAM,ab32389)，室溫過夜。PBS清洗3次，10 min/次。室溫孵育二抗1 h(Roche,11684817910)。DAB顯色后封片，待其充分晾干后，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1非那雄胺成功誘導(dǎo)雄性胎鼠發(fā)生尿道下裂 非那雄胺暴露后導(dǎo)致胎鼠出現(xiàn)典型的尿道下裂表現(xiàn)，尿道開口異常，于陰莖根部開口，且包皮出現(xiàn)分裂，龜頭和部分尿道外露。在正常對照組中，雄性胎鼠無尿道下裂發(fā)生。各組發(fā)生率見表1，隨著暴露濃度的增加，尿道發(fā)生率亦明顯升高，但中劑量和高劑量組之間并無明顯差異。

表1 非那雄胺誘導(dǎo)尿道下裂發(fā)生

2.2陰莖的組織病理學(xué)改變 將橫向包埋好的陰莖組織進行連續(xù)切片，隨后進行HE染色觀察陰莖的組織病理學(xué)變化。HE染色結(jié)果顯示，正常尿道海綿體血竇大小相對均一，白膜與皮膚之間的組織層次多而疏松。與正常組相比，大鼠陰莖與正常組相比，均表現(xiàn)為發(fā)育不良。其中以10 mg/kg.bw 非那雄胺組最為嚴重，分叉尿道海綿體異位嚴重，表現(xiàn)為大小極不一致的血竇之間夾雜著一些纖維結(jié)締組織，無明顯白膜結(jié)構(gòu)，且與皮膚間隔的組織較薄而相對致密(圖1)。因此，在后續(xù)的研究中，我們選擇10 mg.kg.bw的濃度進行細胞實驗。

注：A:正常對照組；B：10 mg/kg非那雄胺組；C：50 mg/kg非那雄胺組；D：100 mg/kg非那雄胺組；圖1 陰莖的組織病理學(xué)改變

2.3尿道板成纖維細胞的鑒定 由于成纖維細胞特異性的表達Vimentin，因此，我們應(yīng)用免疫熒光檢測原代培養(yǎng)細胞Vimentin的表達以確定其為成纖維細胞。90%以上的細胞均表達Vimentin(紅色熒光)，證明我們分離出的原代細胞為成纖維細胞，且純度可用于后續(xù)研究。

2.4尿道板成纖維細胞的增殖活力 隨后，我們檢測了非那雄胺暴露后成纖維細胞的活力變化。與正常對照組相比，非那雄胺組的成纖維細胞增殖明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給予p38或ERK抑制劑處理后，成纖維細胞增殖活力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與對照組無明顯差別(圖2)。

注：*與正常對照組相比，P<0.05;#與非那雄胺組相比，P<0.05。圖2 尿道板成纖維細胞的增殖活力

2.5尿道板成纖維細胞的凋亡增加 Caspase-3是一種蛋白酶，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。p53是一種腫瘤抑制基因，控制細胞周期的啟動。二者均促使細胞發(fā)生凋亡。因此，我們檢測這兩個基因在成纖維細胞的蛋白表達水平。免疫組化結(jié)果顯示，p53和caspase-3在兩組中均有表達，且定位于細胞核，但趨勢不是很明顯(圖3)。這可能是由于免疫組化更趨向于檢測目的蛋白的定位而非定量，因此，我們隨后采用Western blot檢測這兩個基因的蛋白表達水平。Western blot結(jié)果顯示(圖4)， Caspase-3和p53表達模式是一致的，二者在非那雄胺組中的蛋白水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，p38抑制劑組和ERK抑制劑組中Caspase-3和P53的蛋白水平高于非那雄胺組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：*與正常對照組相比，P<0.05；#與非那雄胺組相比，P<0.05。圖4 Caspase-3和p53在尿道板成纖維細胞中的免疫組化結(jié)果

3 討 論

尿道下裂是除隱睪外小兒最常見的泌尿先天畸形，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，主要表現(xiàn)為尿道口開口異位，陰莖下彎和包皮分布異常[6]。在我國，城市的發(fā)病率明顯高于農(nóng)村[7]。因此，對尿道下裂發(fā)生機制的研究有助于臨床治療和預(yù)防該疾病。

由于GD14～GD21是尿道發(fā)育的關(guān)鍵時期[8]，因此，我們在GD8～GD16每天連續(xù)給予梯度劑量的非那雄胺，干擾胎鼠陰莖及尿道的發(fā)育，構(gòu)建尿道下裂的SD雄鼠模型。結(jié)果顯示，雖然3種非那雄胺暴露劑量均不會影響性別分化和雄性胎鼠的體重，但10 mg/kg非那雄胺即可成功導(dǎo)致雄性胎鼠發(fā)生尿道下裂，HE染色顯示，大鼠陰莖發(fā)育不良。其中以10 mg/kg非那雄胺組最為嚴重，因此，我們認為10 mg/kg為構(gòu)建尿道下裂SD大鼠的最佳劑量，非那雄胺可作為構(gòu)建尿道下裂動物模型的優(yōu)選藥物。尿道形成的關(guān)鍵步驟是尿道板兩側(cè)隆起向腹側(cè)卷曲并在中線融合形成尿道縫，當融合過程受阻將導(dǎo)致尿道形成障礙。有學(xué)者證實，尿道縫形成包括3種機制：細胞凋亡[9]、細胞遷移[10]和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。其中，細胞凋亡是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可去除不需要的或異常的細胞，在生物體的進化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細胞凋亡與胚胎發(fā)生和發(fā)展等密切相關(guān)，在管狀器官的隆起融合及腔化中更是起著關(guān)鍵作用[12]。尿道發(fā)育依賴于尿道襞和尿道板上皮腔化在中縫吻合，凋亡減少將導(dǎo)致尿道板腔化受阻、上皮殘留、阻礙間質(zhì)吻合進而影響尿道縫形成[13]。當Hoxa13或BMPr1a基因發(fā)生變異時，尿道下裂小鼠陰莖中發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量顯著減少[14-15]。DEHP誘導(dǎo)的尿道下裂小鼠陰莖中，細胞的凋亡也是明顯減少的[16]。值得注意的是，這些研究均是以陰莖細胞或生殖結(jié)節(jié)成纖維細胞為對象。由于尿道板是陰莖及尿道發(fā)育的分子信號中心，對尿道下裂發(fā)病機制的深入研究必須建立在正常尿道發(fā)育機理的基礎(chǔ)之上，因此，在本研究中，我們選擇尿道板成纖維細胞作為研究對象。在本研究中，我們亦發(fā)現(xiàn)在尿道下裂的發(fā)生過程中，尿道板成纖維細胞凋亡減少，且其增殖能力有所提升，這是以往研究沒有發(fā)現(xiàn)的。因此，我們推測在正常尿道發(fā)育過程中，尿道板成纖維細胞的增殖和凋亡必須處于一種平衡的狀態(tài)，若凋亡和增殖狀態(tài)失衡，尿道板則不能融合形成尿道縫，進而導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次應(yīng)用非那雄胺成功構(gòu)建出尿道下裂的SD大鼠模型，使用劑量顯著小于DBP和DEHP等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有明顯的優(yōu)勢，可作為建立尿道下裂動物模型的優(yōu)選藥物。尿道板成纖維細胞的增殖和凋亡的異常是導(dǎo)致尿道下裂組發(fā)生的關(guān)鍵原因。