王佳雯，盧 潔，姚 托，葉靈通，王江勇

（1. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 3. 惠州學(xué)院，廣東 惠州 516007）

環(huán)境脅迫會(huì)影響貝類(lèi)代謝及能量收支平衡，使免疫相關(guān)酶活性下降，降低機(jī)體免疫防御能力，影響貝類(lèi)的生長(zhǎng)和存活[1-2]。氨氮是貝類(lèi)蛋白質(zhì)代謝的分解產(chǎn)物，當(dāng)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度過(guò)高時(shí)，容易對(duì)水生動(dòng)物體內(nèi)的酶起到催化作用。氨氮常以離子氨和非離子氨的形式存在于水體中，非離子氨具有脂溶性能夠穿過(guò)細(xì)胞膜[3]，因此還會(huì)影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使貝類(lèi)生長(zhǎng)受到抑制[4]。鹽度是影響水生動(dòng)物生理代謝、分布等的重要環(huán)境因子之一[5]。貝類(lèi)能適應(yīng)一定的鹽度范圍，并根據(jù)鹽度的高低來(lái)調(diào)節(jié)自身滲透壓，從而保持正常的生長(zhǎng)繁殖，若超出適應(yīng)范圍，則會(huì)影響其正常的生理代謝[6]?；【瞧毡榇嬖诘暮Ｑ蠹?xì)菌[7]，水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大的細(xì)菌性疾病是由弧菌屬細(xì)菌引起的[8]，其胞外產(chǎn)物是主要的致病因子[9]。脂多糖 (LPS) 是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成部分，具有免疫調(diào)節(jié)作用，是貝類(lèi)非特異性免疫的重要激活劑[10]，可激活巨噬細(xì)胞活性增強(qiáng)機(jī)體吞噬能力。干露會(huì)影響貝類(lèi)生長(zhǎng)代謝，離開(kāi)水體后，貝類(lèi)的呼吸功能受到抑制[11]，長(zhǎng)期暴露在空氣中會(huì)導(dǎo)致貝類(lèi)氧化應(yīng)激[12]，甚至死亡。與其他不利環(huán)境條件一樣，干露可引起活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 過(guò)量，造成脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[13-14]，還會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)酶活性的變化。

中國(guó)是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國(guó)，2019年貝類(lèi)總產(chǎn)量約 1 439×104t，其中牡蠣產(chǎn)量居貝類(lèi)總產(chǎn)量之首，約 522×104t[15]。香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis) 主要分布在長(zhǎng)江以南[16]，是我國(guó)南方海域重要的養(yǎng)殖品種，其含有豐富的蛋白質(zhì)，肉味鮮美，具有較高的醫(yī)藥價(jià)值[17-18]。香港牡蠣在我國(guó)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位[16]，是兩廣地區(qū)牡蠣養(yǎng)殖中最主要的種類(lèi)。在養(yǎng)殖或運(yùn)輸過(guò)程中，降雨干旱導(dǎo)致的生理環(huán)境急劇變化，長(zhǎng)時(shí)間的空氣暴露和溫度波動(dòng)等均會(huì)使牡蠣受到多種環(huán)境壓力。急性的物理應(yīng)激會(huì)影響牡蠣的免疫功能，造成免疫酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致其成活率下降，這是牡蠣大規(guī)模死亡的原因之一[19-20]。

研究證實(shí)，鹽度[21]、氨氮[22]的改變，干露狀態(tài)[23]及弧菌感染[24]等應(yīng)激刺激會(huì)引起貝類(lèi)體內(nèi)代謝發(fā)生重要變化，對(duì)其免疫指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響。免疫相關(guān)酶活性是評(píng)估環(huán)境應(yīng)激下貝類(lèi)健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[25]，可反映貝類(lèi)氧化應(yīng)激水平的免疫反應(yīng)，對(duì)于了解貝類(lèi)的健康狀況及其對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性具有重要意義。為探究環(huán)境因子脅迫對(duì)香港牡蠣免疫指標(biāo)的影響，本研究采用氨氮、干露、鹽度脅迫和弧菌感染香港牡蠣，測(cè)定了各種脅迫條件下香港牡蠣肝胰腺組織中超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、堿性磷酸酶 (AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、總抗氧化能力 (T-AOC)、一氧化氮合酶(NOS)、過(guò)氧化物酶 (POD) 活性與丙二醛 (MDA)含量的變化，旨在找出香港牡蠣對(duì)環(huán)境因子變化敏感的1～2個(gè)免疫指標(biāo)，揭示香港牡蠣在適應(yīng)環(huán)境因子脅迫過(guò)程中免疫指標(biāo)的變化規(guī)律，監(jiān)測(cè)香港牡蠣的生態(tài)健康養(yǎng)殖，為其養(yǎng)殖推廣提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用香港牡蠣購(gòu)于廣州市黃沙水產(chǎn)市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)個(gè)體為同一環(huán)境條件下養(yǎng)殖的牡蠣，體質(zhì)量為(115.18±16.45) g。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前牡蠣在水族缸暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)溫度為 (25±1) ℃，鹽度為20，氨氮質(zhì)量濃度低于 0.05 mg?L–1，pH 為 8.1±0.1，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每天定時(shí)投餌、換水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，在確定香港牡蠣 96 h 氨氮脅迫半致死濃度為 60 mg?L–1的基礎(chǔ)上，設(shè)置 0 mg?L–1(對(duì)照組)、6 mg?L–1(低氨氮組) 和 60 mg?L–1(高氨氮組) 3個(gè)濃度梯度。向各實(shí)驗(yàn)組添加氯化銨 (NH4Cl)，使水體氨氮終濃度與實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度相同。每隔8 h使用E-1456水質(zhì)分析儀 (德國(guó) Dechem-Tech.GmbH 公司) 檢測(cè)各水體的氨氮濃度，將其調(diào)整為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的氨氮濃度。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，每組15只香港牡蠣，進(jìn)行24 h的脅迫實(shí)驗(yàn)。所有組的水溫、鹽度、充氣量等養(yǎng)殖條件均與暫養(yǎng)期間相同。

1.2.2 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3個(gè)鹽度梯度[26]，其中鹽度20為對(duì)照組，鹽度30為高鹽組，鹽度3為低鹽組，每個(gè)鹽度均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行15只香港牡蠣。實(shí)驗(yàn)水體由自來(lái)水加海水晶混勻調(diào)制，實(shí)驗(yàn)前水體均充分曝氣。牡蠣在鹽度脅迫后的72 h隨機(jī)取樣。所有組的水溫、pH、充氣量等養(yǎng)殖條件均與暫養(yǎng)期間相同。

1.2.3 免疫感染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置哈維弧菌(Vibrio harveyi) 組、LPS組、對(duì)照組，對(duì)照組注射無(wú)菌養(yǎng)殖海水50 μL，實(shí)驗(yàn)組分別注射50 μL哈維弧菌 (107CFU?mL–1) 菌液和 LPS (0.5 mg?L–1) 溶液，進(jìn)行24 h感染實(shí)驗(yàn)。每組均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行15只香港牡蠣。所有組的水溫、pH、充氣量等養(yǎng)殖條件均與暫養(yǎng)期間相同。

1.2.4 干露脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將香港牡蠣分別置于25和4 ℃下干露處理7 d，并在第0、第1、第3、第5和第7天取樣。2個(gè)溫度均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行50只香港牡蠣。溫度25和4 ℃分別由培養(yǎng)箱和冰箱控制。

1.3 樣品采集與保存

4個(gè)脅迫實(shí)驗(yàn)均采用同一方法取樣，即從每個(gè)平行中隨機(jī)取出3只香港牡蠣，每組共9只，分離出肝胰腺，液氮速凍后于?80 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 樣品處理 將所取樣品與勻漿介質(zhì)(0.86% 的生理鹽水) 以質(zhì)量∶體積=1∶9 (g·mL–1)比例在冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制備成10%的組織勻漿。之后 2 500 r·min–1離心 10 min，取上清液進(jìn)行相關(guān)免疫指標(biāo)測(cè)定。免疫酶活的測(cè)定均采用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒，實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 ACP和 AKP活性測(cè)定 以微量酶標(biāo)法測(cè)定 ACP (貨號(hào) A060-2) 和 AKP (A059-2) 活性，ACP和AKP分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測(cè)定酶活性的高低。

1.4.3 MDA 含量測(cè)定 用硫代巴比妥酸法(TBA法) 測(cè)定MDA含量 (A003-1)，過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，可計(jì)算出MDA含量。

1.4.4 SOD 活性測(cè)定 以羥胺法測(cè)定 SOD 活性(A001-3)，通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生?O2?，?O2?與羥胺反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)顯色劑作用呈紫紅色，而SOD對(duì)?O2?專(zhuān)一性抑制，利用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光值差異，即可計(jì)算出樣品的SOD活性。

1.4.5 T-AOC 活性測(cè)定 以微板法 (ABTS法) 測(cè)定 T-AOC (A015-1-1)，2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 (ABTS) 在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的 ABTS·+，在抗氧化物存在時(shí)，ABTS·+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，在405或734 nm處測(cè)定ABTS·+的吸光度即可測(cè)定比計(jì)算出樣品T-AOC。

1.4.6 CAT 活性測(cè)定 以可見(jiàn)光法測(cè)定 CAT 活性(A007-1-1)，CAT 分解過(guò)氧化氫 (H2O2) 的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，通過(guò)A-5082 TACAN 酶標(biāo)儀 (奧地利 Tecan 有限公司) 在 405 nm處測(cè)定其生成量，可計(jì)算出CAT的活性。

1.4.7 NOS活性測(cè)定 以比色法測(cè)定 NOS活性(A014-2)，NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成一氧化氮(NO)，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計(jì)算出NOS活性。

1.4.8 POD 活性測(cè)定 以比色法測(cè)定 POD 活性(A084-1-1)，利用POD催化H2O2反應(yīng)的原理，通過(guò)測(cè)定420 nm處吸光度單獨(dú)變化得出其酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)免疫指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)。組間差異采用 Duncan's多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫下香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的變化

方差分析表明氨氮脅迫對(duì)香港牡蠣ACP活性具有顯著影響 (圖1-a)，高濃度組和低濃度組中香港牡蠣ACP活性均顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)，SOD活性與ACP活性變化一致 (圖1-d)。對(duì)照組MDA顯著高于低氨氮組 (P<0.05，圖1-c)。POD活性隨氨氮濃度升高而降低 (圖1-h)，T-AOC也有相似的變化趨勢(shì) (圖1-e)，但均無(wú)顯著差異 (P>0.05)。此外，CAT活性隨氨氮濃度的增加而下降，高濃度氨氮組CAT活性顯著低于對(duì)照組 (P<0.05，圖 1-f)。

2.2 鹽度脅迫下香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的變化

在不同鹽度的環(huán)境中，香港牡蠣肝胰腺中ACP、AKP、T-AOC和POD活性及MDA含量均無(wú)顯著變化 (P>0.05，圖2)。在高鹽度脅迫下，SOD活性顯著高于對(duì)照組 (P<0.05，圖2-d)，高鹽度也顯著誘導(dǎo)NOS活性上升 (P<0.05，圖2-g)。與其他酶活相比，無(wú)論是在低鹽度還是高鹽度中，實(shí)驗(yàn)組CAT活性均顯著高于對(duì)照組 (P<0.05，圖2-f)。

圖2 鹽度脅迫對(duì)香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的影響Figure 2 Effects of salinity stress on immune enzyme activity in hepatopancreas of C. hongkongensis

2.3 免疫感染后香港牡蠣肝胰腺免疫酶活性的變化

ACP、SOD活性及MDA含量在2種免疫刺激過(guò)程中均無(wú)顯著變化 (圖3)。LPS組的AKP活性顯著高于哈維弧菌組 (P<0.05，圖3-b)。哈維弧菌免疫感染組T-AOC活性顯著低于對(duì)照組和LPS組(P<0.05，圖3-e)，LPS組NOS活性顯著高于對(duì)照組和哈維弧菌組 (P<0.05，圖3-g)。此外，2種免疫刺激均顯著降低了香港牡蠣肝胰腺組織中CAT活性 (P<0.05，圖3-f)。對(duì)照組POD活性均高于2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，且顯著高于LPS組 (P<0.05，圖3-h)。

圖3 免疫刺激對(duì)香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的影響Figure 3 Effects of immune stimulation on immune enzyme activity in hepatopancreas of C. hongkongensis

2.4 干露條件下香港牡蠣肝胰腺中CAT活性的變化

干露實(shí)驗(yàn)前后，香港牡蠣肝胰腺中CAT活性有顯著差異，即干露初期 (0 d) 與干露后期 (7 d) 相比顯著下降 (P<0.05)。25 ℃干露第3天，CAT活性顯著低于干露第0和第5天 (P<0.05，圖4-a)。溫度為4 ℃，隨著干露時(shí)間持續(xù)，CAT活性有顯著差異 (圖4-b)。香港牡蠣肝胰腺中CAT活性在第1和第7天時(shí)顯著低于干露初期 (P<0.05)，在第3天，與干露第7天相比CAT活性又有顯著上升(P<0.05)。

圖4 25 ℃ (a) 和4 ℃ (b) 干露條件對(duì)香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的影響不同小寫(xiě)字母代表各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組間存在顯著差異 (P<0.05)Figure 4 Effects of air exposure conditions at 25 ℃ (a) and 4 ℃ (b) on immune enzyme activity in hepatopancreas of C. hongkongensisDifferent lowercase letters indicate significant difference between the experimental groups at different time (P<0.05).

3 討論

代謝過(guò)程中，環(huán)境脅迫導(dǎo)致生物機(jī)體的生理環(huán)境發(fā)生變化，使其體內(nèi)自由基數(shù)量增加。自由基可以通過(guò)各種還原反應(yīng)保護(hù)有機(jī)體，但過(guò)量則造成機(jī)體損害，導(dǎo)致組織損傷[27]。抗氧化酶 (T-AOC、CAT、SOD) 參與機(jī)體對(duì)自由基的初級(jí)抗氧化保護(hù)，這些酶在免疫應(yīng)答和代謝過(guò)程中產(chǎn)生，以防止脂肪酸氧化，減少ROS對(duì)機(jī)體的毒性作用，并保護(hù)生物體免受氧化損傷[28]。

貝類(lèi)因缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，其防御機(jī)制主要依賴(lài)于先天免疫反應(yīng)。ACP和AKP均為水生動(dòng)物中重要的溶酶體酶，既可參與非特異性免疫作用[29]，也可參與各種代謝過(guò)程，如解毒、代謝、大分子生物合成等。本研究中各種濃度氨氮均誘導(dǎo)了ACP活性顯著升高 (P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)的氨氮脅迫會(huì)誘導(dǎo)中華小長(zhǎng)臂蝦 (Palaemonetes sinensis)體內(nèi)ACP活性顯著上升[30]。粟志民等[22]報(bào)道在低濃度氨氮 (1.25～10 mg?L–1) 條件下，馬氏珠母貝(Pinctada martensii) 血清中ACP活性隨氨氮濃度的增加而升高，從而有效提高了機(jī)體的抗病力和免疫力，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；但在高濃度氨氮 (20～40 mg?L–1) 下，馬氏珠母貝的 ACP活性隨氨氮濃度增加而急劇下降，這與本研究中高濃度氨氮組的變化有所不同。原因可能是本實(shí)驗(yàn)的采樣時(shí)間點(diǎn)(24 h) 與前者 (72 h) 不同，短時(shí)間的氨氮脅迫不會(huì)使香港牡蠣出現(xiàn)免疫疲勞，故未觀察到下降趨勢(shì)。因此，肝胰腺中ACP活性增加可能是香港牡蠣為維持自身酸堿平衡和離子平衡而通過(guò)去磷酸化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)主動(dòng)調(diào)節(jié)和適應(yīng)短期氨氮脅迫的結(jié)果。AKP是非特異性磷酸單酯酶，主要作用于細(xì)胞跨膜運(yùn)輸過(guò)程，是所有動(dòng)物細(xì)胞所固有的質(zhì)膜酶，但在氨氮、鹽度及免疫刺激下，牡蠣肝胰腺組織中AKP活性變化均不顯著。王帥等[31]研究表明低鹽脅迫對(duì)中國(guó)血蛤 (Hiatula chinensis) AKP的影響不顯著。本研究中，可能是由于過(guò)大的環(huán)境壓力致使香港牡蠣的AKP活性受到抑制，而誘導(dǎo)需要一定的反應(yīng)時(shí)間，也可能是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)受到了嚴(yán)重?fù)p害。

MDA含量可以反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過(guò)氧化損傷程度，是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)。氨氮脅迫下香港牡蠣體內(nèi)MDA含量顯著下降 (P<0.05)，SOD活性顯著上升。本研究結(jié)果與Florence等[32]報(bào)道的金屬對(duì)紫貽貝 (Mytilus edulis) 和長(zhǎng)牡蠣 (C. gigas) 脂質(zhì)過(guò)氧化影響的結(jié)果相似，這可能是因?yàn)榘⊿OD在內(nèi)的體內(nèi)抗氧化酶體系增強(qiáng)，限制了MDA的生成。

SOD廣泛存在于機(jī)體中，可以將?O2?轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。本研究中，低氨氮組和高氨氮組SOD活性均呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)作用 (P<0.05)，與方斑東風(fēng)螺 (Babylonia areolata)[33]的研究結(jié)果相似；在鹽度脅迫下，高鹽度組牡蠣肝胰腺中的SOD活性顯著升高 (P<0.05)，這與馬氏珠母貝[22]的研究結(jié)果一致。因此，SOD活性升高可能是因?yàn)榘钡螓}度等環(huán)境脅迫因子使牡蠣體內(nèi)?O2?生成增加，進(jìn)而誘導(dǎo)了牡蠣自身機(jī)體的免疫防御機(jī)制，使SOD活性顯著上調(diào)，催化?O2?發(fā)生歧化反應(yīng)以保持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。

T-AOC主要用于清除體內(nèi)過(guò)量的ROS，從而保護(hù)機(jī)體免受損害，是反映機(jī)體總抗氧化能力的重要綜合性指標(biāo)。在感染哈維弧菌后，香港牡蠣肝胰腺的T-AOC活性顯著下降 (P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，金屬蛋白酶的脅迫會(huì)使大菱鲆 (Scophthalmus maximus) T-AOC活性顯著降低[34]。金屬蛋白酶屬于毒力因子，有較強(qiáng)致病性，哈維弧菌中也存在該蛋白酶。由此推測(cè)，哈維弧菌中金屬蛋白酶的脅迫使得香港牡蠣體內(nèi)積累了過(guò)量的ROS，導(dǎo)致其肝胰腺中T-AOC活性受到抑制，進(jìn)而抑制了香港牡蠣機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)。

NOS催化L-精氨酸合成NO，NO具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，參與機(jī)體免疫調(diào)控[35]。在高鹽度脅迫下，NOS活性顯著升高 (P<0.05)。與對(duì)照組相比，LPS組的NOS活性也顯著升高 (P<0.05)。LPS可誘導(dǎo)炎癥因子并通過(guò)NF-kB等轉(zhuǎn)錄途徑激活大量基因，實(shí)現(xiàn)機(jī)體的免疫應(yīng)答[36]。Shen等[37]研究表明LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞中NOS的表達(dá)和NO的產(chǎn)生，能夠刺激細(xì)胞中的NF-kB通路。蔣秋芬[38]對(duì)貝類(lèi)NO系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下NOS活性與NO含量顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了NO系統(tǒng)參與貝類(lèi)的免疫防御過(guò)程。因此，本研究中NOS在被誘導(dǎo)后合成大量的NO，參與到LPS誘發(fā)的免疫防御調(diào)節(jié)。

POD作為一種抗氧化酶，可以催化H2O2和其他底物反應(yīng)，消耗H2O2，在機(jī)體氧化應(yīng)激條件下發(fā)揮重要作用。本研究中，LPS明顯抑制了POD活性 (P<0.05)，而哈維弧菌組卻無(wú)顯著變化。Saleem等[39]發(fā)現(xiàn)牡蠣具有識(shí)別不同微生物抗原的能力，且能作出不同的機(jī)體反應(yīng)，原因可能是香港牡蠣在分別注射LPS和哈維弧菌后免疫酶活性存在差異。在鹽度脅迫下，POD活性較其他抗氧化酶敏感性較低，這一結(jié)果與Liu等[40]的相似。

不同于POD，CAT主要催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，從而達(dá)到消耗H2O2的目的[41]，保持體內(nèi)代謝平衡。本研究表明，氨氮脅迫和免疫刺激均使CAT活性下降，但鹽度脅迫導(dǎo)致CAT活性上升。隨著氨氮濃度的增加，香港牡蠣SOD和ACP活性呈升高趨勢(shì)，高氨氮組CAT活性顯著降低 (P<0.05)，對(duì)方斑東風(fēng)螺[33]的研究也有相似結(jié)果，這可能是由于氨氮濃度上升，使機(jī)體大量產(chǎn)生?O?2等超氧化產(chǎn)物，誘導(dǎo)SOD活性升高將其轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，但?O?2對(duì)機(jī)體也存在抑制作用，大量?O?2使CAT活性難以升高甚至降低；金屬蛋白酶具有抑制大菱鲆血清CAT活性的作用[34]，這與本研究中哈維弧菌感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，原因可能是蛋白酶破壞了香港牡蠣體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)ROS在體內(nèi)積累使CAT活性下降。LPS也可以導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激。本研究中LPS誘導(dǎo)的ROS含量超過(guò)了機(jī)體的耐受程度，因未能及時(shí)清除使得CAT活性降低。在鹽度脅迫下，實(shí)驗(yàn)組中CAT活性均顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)。李庭古[42]研究指出，鹽度會(huì)影響蝦蟹類(lèi)的滲透壓，蝦蟹類(lèi)主要通過(guò)改變代謝狀況來(lái)適應(yīng)不同的鹽度環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果相似，在滲透壓主動(dòng)調(diào)節(jié)過(guò)程中，需要排出多余的鹽分或水分來(lái)調(diào)節(jié)透滲壓。此外，當(dāng)機(jī)體內(nèi)外存在較高滲透壓梯度時(shí)，呼吸器官首先受到損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量增加，這時(shí)需要更多的CAT來(lái)減少氧自由基對(duì)機(jī)體造成的損害。

通過(guò)上述3個(gè)脅迫實(shí)驗(yàn)，可以推測(cè)香港牡蠣在受到環(huán)境因子脅迫時(shí)，CAT可能適合作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)記物。為了驗(yàn)證這一個(gè)假設(shè)，本研究檢測(cè)了不同溫度與不同時(shí)間點(diǎn)干露脅迫下香港牡蠣肝胰腺中CAT活性的變化，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間干露脅迫會(huì)降低香港牡蠣的非特異性免疫力，使CAT活性發(fā)生顯著變化，這與Cui等[23]對(duì)白仿刺參 (Apostichopus japonicus) 的研究結(jié)果類(lèi)似。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出2個(gè)溫度的干露脅迫CAT 活性均呈下降、恢復(fù)、再下降趨勢(shì)，雖然大體變化趨勢(shì)相近，但存在時(shí)間上的差異變化。在4 ℃干露實(shí)驗(yàn)組中，由于溫度驟變使CAT活性在第1天顯著降低；25 ℃干露實(shí)驗(yàn)組在第3天CAT活性才顯著降低，原因可能是當(dāng)機(jī)體處于不利環(huán)境因素條件下，體內(nèi)抗氧化酶活性受到限制。表明極端溫度的干露脅迫對(duì)香港牡蠣機(jī)體的損傷程度更高，因?yàn)?5 ℃是香港牡蠣適宜生存的溫度，即使是在干露條件下其體內(nèi)酶活性也并未從開(kāi)始就劇烈變化，而是有一個(gè)延緩的趨勢(shì)。不利因素在時(shí)間的加持下逐漸激發(fā)體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，致使CAT活性上升。4 ℃實(shí)驗(yàn)組第3與第7 天相比CAT活性差異顯著，25 ℃實(shí)驗(yàn)組第3天CAT活性顯著高于第5天。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，牡蠣體內(nèi)自由基的清除速率不及產(chǎn)生速率，致使自由基大量積累，破壞了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致CAT活性下降。這可能是7 d干露后CAT活性比0 d顯著降低的主要原因。CAT活性在不同溫度與時(shí)間的干露脅迫下表現(xiàn)出敏感性，驗(yàn)證了CAT適合作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)記物這一觀點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究表明，抗氧化酶是香港牡蠣在外界因子脅迫下一種敏感的生理指標(biāo)。環(huán)境因子脅迫會(huì)增加體內(nèi)的自由基含量，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗氧化防御反應(yīng)，而自由基在體內(nèi)積累過(guò)度會(huì)產(chǎn)生毒害作用。由此得出結(jié)論，香港牡蠣肝胰腺的CAT適合作為監(jiān)測(cè)環(huán)境因子脅迫的潛在生物標(biāo)記物，用于監(jiān)測(cè)環(huán)境因子脅迫下香港牡蠣的氧化應(yīng)激反應(yīng)。