葛 輝 ，吳建紹，楊章武，吳麗云，張 哲，杜秀萍，洪 偉，林克冰，林 琪，林嘉銘，周 宸*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013；2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，原產(chǎn)于厄瓜多爾和其他南美太平洋沿岸水域，俗稱南美白對(duì)蝦，是世界三大對(duì)蝦養(yǎng)殖種類之一[1]。由于生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)、可高密度養(yǎng)殖、鹽度適應(yīng)范圍大，因此其養(yǎng)殖產(chǎn)量在世界對(duì)蝦總產(chǎn)量中占有很大比例[2]。然而，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷提高，對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，導(dǎo)致對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)病害日益嚴(yán)重。疾病的暴發(fā)已成為阻礙對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素之一[3]。

目前對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中大約有20種不同的病毒，已造成大量的對(duì)蝦死亡和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。其中，傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)是蝦的主要病原之一。IHHNV是一種無(wú)包膜二十面體的單鏈線性DNA病毒，也稱細(xì)角濱對(duì)蝦濃核病毒(Penaeusstylirostrisdensovirus，PstDNV)[6]。IHHNV自1981年在美國(guó)夏威夷地區(qū)的細(xì)角濱對(duì)蝦(Penaeusstylirostris)中首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，迅速向世界各地傳播，在北美、南美、美洲中部、加勒比等印度洋和太平洋的許多地區(qū)均有報(bào)道[7]。

IHHNV宿主種類繁多，包括凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponensis)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、寬溝對(duì)蝦(Penaeuslatisulcatus)等[8]。雖然該病毒感染凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦后不會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦的大量死亡，但該病毒對(duì)對(duì)蝦仔蝦的危害較大[9]。仔蝦感染該病毒后，會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，以及表皮崎形引起的觸角鞭毛皺起、額劍彎曲、表皮粗糙或殘缺、腹部甲殼病變、尾節(jié)彎曲，還有規(guī)格參差不齊等癥狀，稱為慢性矮小殘缺綜合征(Runt-deformity syndrome，RDS)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[10]，因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health，OIE)將IHHNV導(dǎo)致的傳染性皮下及造血器官壞死病列為必須申報(bào)的甲殼類疾病之一[11]。

感染IHHNV的存活對(duì)蝦將終生攜帶該病毒，并能通過(guò)受精卵將病毒垂直傳播到下一代[12]，或通過(guò)水平傳播傳遞到其他個(gè)體[13]。因此，在還沒(méi)有有效的防治措施來(lái)控制IHHNV感染的情況下，早檢測(cè)早預(yù)防并控制疾病的傳播顯得尤為重要。

目前，動(dòng)物疫病檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化方法、分離鑒定方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、蛋白質(zhì)指紋圖譜分析方法等[14-15]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)標(biāo)準(zhǔn)推薦的IHHNV檢測(cè)方法是熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法和常用PCR方法。基于PCR的檢測(cè)方法靈敏、特異，但是需要昂貴的設(shè)備和相對(duì)復(fù)雜的步驟，耗時(shí)約2 h，在實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用明顯不足。病原體的快速檢測(cè)與鑒定需要一種真正簡(jiǎn)單和快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本研究人員Notomi等于2000年首次開發(fā)的一種在體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的新技術(shù)[16]。其基本原理是對(duì)靶基因的6個(gè)特異部位設(shè)計(jì)引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增，不需要模板的熱變性和長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)，對(duì)設(shè)備要求低[17-18]。這些優(yōu)點(diǎn)使得它在流行性細(xì)菌或病毒的定性和定量檢測(cè)等方面有著廣泛的應(yīng)用[19]。因此，本研究根據(jù)IHHNV病毒基因中的一段序列，采用Primer Explorer V4軟件設(shè)計(jì)LAMP特異性引物組合，建立了一種IHHNV-LAMP檢測(cè)技術(shù)，以期為養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)IHHNV病毒提供快速高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

凡納濱對(duì)蝦采自于漳浦縣佛曇鴻達(dá)水產(chǎn)育苗場(chǎng)。IHHNV(傳染性皮下及造血組織壞死病毒核酸)、NNV(神經(jīng)壞死病毒核酸)、魚核酸(斜帶石斑魚總核酸)、沙門氏菌、綠膿桿菌和檸檬酸桿菌等核酸均-80℃保存于本實(shí)驗(yàn)室。BstDNA聚合酶購(gòu)自紐英倫(NEB)生物技術(shù)(北京)有限公司；pUC19載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；序列合成和DNA測(cè)序委托上海捷瑞生物工程有限公司完成；其余試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 傳染性皮下及造血組織壞死病毒LAMP引物篩選

根據(jù)GenBank發(fā)布的IHHNV基因組序列及相關(guān)文獻(xiàn)資料，選取高度保守序列區(qū)的一段序列，按照LAMP引物的設(shè)計(jì)原則，采用PrimerExplorer V4軟件設(shè)計(jì)LAMP引物。共設(shè)計(jì)了5套引物，經(jīng)篩選后選用其中一套共6條引物，選用的引物序列如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.3 LAMP反應(yīng)體系

將IHHNV-2引物以IHHNV病毒的核酸和水為模板，在63℃下進(jìn)行LAMP反應(yīng)60 min，其中，各引物的用量分別為FIP(40 μmol/L)、BIP(40 μmol/L)各1.0 μL，F(xiàn)3(5 μmol/L)、B3(5 μmol/L)各1.0 μL，環(huán)引物(20 μmol/L)1.0 μL；以NNV的總RNA為模板的反應(yīng)體系中添加逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線分析擴(kuò)增結(jié)果。其中，引物擴(kuò)增體系如表2所示。

表2 IHHNV-LAMP擴(kuò)增引物的篩選體系

1.4 傳染性皮下及造血組織壞死病毒陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的IHNNV病毒基因，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成該病毒的部分核酸序列。將該合成的核酸序列與克隆載體PUC19連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)平板上。從平板挑選40個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定重組子(PUC19-IHNNV)，產(chǎn)物經(jīng)由1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，交由上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序，鑒定重組質(zhì)粒PUC19-IHNNV中的插入序列。

IHHNV-2引物分別以IHHNV病毒核酸、PUC19-IHHNV和水為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，在63℃下進(jìn)行LAMP反應(yīng)60 min。同時(shí)IHHNV-2引物分別以PUC19-IHHNV和稀釋100倍的PUC19-IHHNV模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，每組做2個(gè)平行，以檢測(cè)質(zhì)粒稀釋前后質(zhì)量。

1.5 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)

采用篩選后的引物組，分別以IHHNV(傳染性皮下及造血組織壞死病毒核酸)、NNV(神經(jīng)壞死病毒核酸)、魚核酸(斜帶石斑魚總核酸)、沙門氏菌、綠膿桿菌和檸檬酸桿菌等核酸為模板，在63℃下進(jìn)行LAMP反應(yīng)60 min，以檢測(cè)本研究建立的IHHNV-LAMP檢測(cè)方法的特異性。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.6 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物靈敏度檢測(cè)

用濃度為315 ng/μL(5.29×1010copies/μL)的IHHNV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，?0倍梯度稀釋，做靈敏度實(shí)驗(yàn)。

采用篩選后的引物組，分別以濃度為3.15 ng/μL(5.29×108copies/μL)、315 pg/μL(5.29×107copies/μL)、31.5 pg/μL(5.29×106copies/μL)、3.15 pg/μL(5.29×105copies/μL)、315 fg/μL(5.29×104copies/μL)、31.5 fg/μL(5.29×103copies/μL)、3.15 fg/μL(529 copies/μL)、315 ag/μL(52.9 copies/μL)、31.5 ag/μL(5.29 copies/μL)、3.15 ag/μL(0.529 copies/μL)的IHHNV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板；每個(gè)體系中加入2 μL模板，水作為陰性對(duì)照組，在63℃下進(jìn)行LAMP反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 不同IHHNV檢測(cè)方法的靈敏度比較分析

為確定本研究建立的IHHNV-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度，以構(gòu)建的pUC19-IHHNV質(zhì)粒，用QuantusTMFluorometer測(cè)定1∶100稀釋的pUC19-IHHNV質(zhì)粒濃度。根據(jù)計(jì)算的拷貝數(shù)梯度稀釋質(zhì)粒，使稀釋倍數(shù)分別為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109倍。按OIE推薦的普通PCR、qPCR的要求進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。普通PCR、qPCR的擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

根據(jù)如下公式計(jì)算1∶100稀釋pUC19-IHHNV質(zhì)粒的拷貝數(shù)：

質(zhì)?？截悢?shù)/μL=

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 傳染性皮下及造血組織壞死病毒LAMP引物篩選

結(jié)果顯示引物IHHNV-1能夠在33 min左右將陽(yáng)性核酸擴(kuò)增出來(lái)，引物IHHNV-2能夠在25 min左右將陽(yáng)性核酸擴(kuò)增出來(lái)，引物IHHNV-4能夠在43 min左右將陽(yáng)性核酸擴(kuò)增出來(lái)，所以含有環(huán)引物的IHHNV-1、IHHNV-2、IHHNV-4引物初步能夠使用，待后續(xù)繼續(xù)驗(yàn)證；本實(shí)驗(yàn)中，取IHHNV-2為實(shí)驗(yàn)引物。引物IHHNV-3在60 min內(nèi)不能擴(kuò)增出陽(yáng)性核酸，引物IHHNV-5雖然能夠在55 min左右將陽(yáng)性核酸擴(kuò)增出來(lái)，但時(shí)間太長(zhǎng)，因此IHHNV-3、IHHNV-5均舍棄。

2.2 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物特異性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示，只有IHHNV病毒的核酸出現(xiàn)擴(kuò)增，其他對(duì)照病毒、細(xì)菌和水均未檢測(cè)出擴(kuò)增結(jié)果，顯色結(jié)果與曲線圖一致。這說(shuō)明建立的以IHHNV-2為引物的IHHNV-LAMP檢測(cè)方法具有良好的特異性。

注：1.IHHNV陽(yáng)性核酸；2.水；3.NNV核酸；4.魚核酸；5.沙門桿菌；6.綠膿桿菌；7.檸檬酸桿菌。

2.3 傳染性皮下及造血組織壞死病毒引物靈敏度檢測(cè)

2.3.1 重組質(zhì)粒pUC19-IHHNV的質(zhì)量檢測(cè)

引物在檢測(cè)時(shí)，質(zhì)粒均在10～16 min出現(xiàn)擴(kuò)增，比提取的IHHNV病毒核酸(36～40 min)擴(kuò)增速度快，這說(shuō)明本研究制備的IHHNV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒優(yōu)良，符合實(shí)驗(yàn)要求。稀釋100倍的IHHNV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒與未稀釋的質(zhì)粒原液均在16 min左右出現(xiàn)擴(kuò)增，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制備的IHHNV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.3.2 IHHNV-2靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

用濃度為315 ng/μL(5.29×1010copies/μL)的PUC19-IHHNV質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，依?0倍梯度稀釋，做靈敏度實(shí)驗(yàn)。第一孔濃度為3.15 ng/μL，每管加入2 μL，以此類推。

引物IHHNV-2的靈敏度檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示：IHHNV病毒陽(yáng)性質(zhì)粒含量在63 ag～6.3 ng均能檢測(cè)到擴(kuò)增，陰性對(duì)照未見擴(kuò)增，可見IHHNV-2引物組的最低檢測(cè)限為63 ag，約10.3 copies。

注：1為3.15 ng/μL；2：315 pg/μL；3：31.5 pg/μL；4：3.15 pg/μL；5：315 fg/μL；6：31.5 fg/μL；7：3.15 fg/μL 8：315 ag/μL；9：31.5 ag/μL；10：3.15 ag/μL；11：水。

2.3.3 不同IHHNV檢測(cè)方法的靈敏度比較

用1∶100稀釋的pUC19-IHHNV質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)梯度稀釋，使稀釋倍數(shù)分別為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109倍，拷貝數(shù)分別為5.04×107copies/μL、5.04×106copies/μL、5.04×105copies/μL、5.04×104copies/μL、5.04×103copies/μL、5.04×102copies/μL、5.04×101copies/μL。梯度稀釋后進(jìn)行qPCR和普通PCR的產(chǎn)物電泳結(jié)果對(duì)比如圖7所示。qPCR至少可檢測(cè)到的稀釋度為109，又因?yàn)槭褂昧? μL質(zhì)粒，則拷貝數(shù)為50.4 copies×8=403.2 copies。同樣的，PCR至少可檢測(cè)到稀釋度為109，拷貝數(shù)為403.2 copies。而從qPCR Cq值數(shù)據(jù)上分析，理論可檢測(cè)到的拷貝數(shù)至少為7.84 copies。

注：A為qPCR；B為普通PCR；M為DNA marker。

3 討論

目前暫無(wú)有效的治療對(duì)蝦病毒病的手段，對(duì)蝦病毒病的防治與控制是一個(gè)復(fù)雜且系統(tǒng)性的工程，涉及到蝦池的消毒殺菌、投飼、使用藥物增強(qiáng)防病能力、藥物治療等諸多方面。近幾年來(lái)隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展以及病毒的研究，IHHNV的檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越成熟且多樣化，其中主要包括普通PCR方法、qPCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、組織病理學(xué)切片等[20-21]。而在現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)中，要選擇最適合且便捷的檢測(cè)方法，才能在實(shí)際運(yùn)用中得到更好的結(jié)果。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蝦IHHNV最常用的檢測(cè)方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，需要復(fù)雜的操作步驟和條件，以及昂貴的儀器，而LAMP反應(yīng)僅在恒溫條件下便可進(jìn)行，只需具有穩(wěn)定熱源的裝置即可，極大地降低了操作難度和儀器成本，更加有利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，最初在2000年由日本研究人員Notomi發(fā)明。該技術(shù)可結(jié)合特定的熒光染料從而出現(xiàn)肉眼可見的顯色反應(yīng)，檢測(cè)人員可以根據(jù)顏色的變化來(lái)得出結(jié)果。因此，LAMP方法已被成功用于多種病毒、真菌、細(xì)菌等病原的分子生物學(xué)檢測(cè)和診斷，甚至在性別鑒定、各種疫病、食品安全的檢測(cè)中也得到應(yīng)用[14，21-22]。LAMP技術(shù)本身也在改進(jìn)和提高，并與其他技術(shù)合并應(yīng)用，如熒光LAMP技術(shù)[23]、Stem Primers在LAMP中的應(yīng)用[24]、橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)方法(LFD)[25]、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分型研究[26]等。由此可見，LAMP方法得到了眾多科研人員的認(rèn)可。而在其他輔助條件下，LAMP方法將有更多更廣泛的應(yīng)用。本研究開發(fā)的IHHNV-LAMP檢測(cè)方法是一種適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的非常有前途的檢測(cè)方法。

本研究對(duì)GenBank收錄的IHHNV基因組序列進(jìn)行比對(duì)并選取高度保守序列區(qū)的一段約1 447 bp的序列。針對(duì)該序列設(shè)計(jì)6條引物，其中包括1對(duì)環(huán)引物，從而把反應(yīng)時(shí)間縮短到30 min以內(nèi)，并以此判別陰陽(yáng)性。與普通PCR相比，本研究在恒溫?zé)崴〖纯赏瓿刹僮?，不需要?duì)模板進(jìn)行熱變性處理，節(jié)省了因溫度循環(huán)而消耗的時(shí)間，對(duì)儀器依賴性小。在63℃下進(jìn)行25～33 min的LAMP檢測(cè)，比李紅梅等的快[23]。很多報(bào)道中曾提到過(guò)，使用PCR診斷IHHNV經(jīng)常有假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，原因主要是IHHNV的部分序列插入到宿主對(duì)蝦的基因組中。在本研究中以水、石斑魚核酸、NNV病毒等6種核酸為模板，均未檢測(cè)到任何IHHNV的擴(kuò)增，表明本方法能夠滿足檢測(cè)需求，也說(shuō)明了本研究所選擇的檢測(cè)序列片段合理。目前為止，對(duì)IHHNV的檢測(cè)已應(yīng)用了多種技術(shù)，其中靈敏度相對(duì)較高的技術(shù)都是基于PCR的擴(kuò)增技術(shù)，包括傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和qPCR技術(shù)。為了驗(yàn)證IHHNV-LAMP檢測(cè)體系的檢測(cè)性能，筆者又構(gòu)建了普通PCR-IHHNV和qPCR-IHHNV檢測(cè)體系。將三者進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，三個(gè)體系都顯示出了很優(yōu)越的檢測(cè)性能。但是，IHHNV-LAMP檢測(cè)體系的靈敏度和特異性優(yōu)于普通PCR-IHHNV檢測(cè)技術(shù)；其次反應(yīng)由于借助了從dNTPs中解離出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，用肉眼即可觀察到反應(yīng)結(jié)果，借助濁度儀可獲得精確的結(jié)果；并且本體系在反應(yīng)體系中添加了鈣黃綠素，有核酸擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物在紫外光下可觀察到黃綠色熒光，不需要復(fù)雜的加熱系統(tǒng)和成像系統(tǒng)；僅需在63℃、25 min內(nèi)就可得出肉眼檢測(cè)結(jié)果，更適合于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)地診斷。

綜上所述，本研究基于GenBank收錄的IHHNV基因組序列所建立的LAMP檢測(cè)方法，不僅操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，特異性好，靈敏度高，成本低廉，而且可以直觀地觀察反應(yīng)的進(jìn)行情況，可用于實(shí)驗(yàn)室快速分析，也適用于對(duì)蝦養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的診斷。