阿迪萊·卡哈曼，伍麥爾·麥海提，布帕提買木·麥麥提，李蓮瑞，黃 新，石長青*

（1．塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3．新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000）

隨著養(yǎng)羊業(yè)高密度、集約化發(fā)展，加之規(guī)模化羊場飼養(yǎng)管理不當(dāng)，往往會同時感染多種病原，造成誤診、濫用藥物和防治困難，導(dǎo)致羊群高致病率和高死亡率。近年來，放線菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌均能引起牛羊和其他家畜的非接觸傳染的慢性病，其中動物感染金黃色葡萄球菌與糞腸球菌較為常見，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于革蘭氏陽性菌中的葡萄球菌屬（Staphylococcus），在自然界中廣泛存在，是常見的人畜共患病原[1]，可引起動物肺炎、敗血癥、心肌炎、腦膜炎等急性感染病和腸炎等慢性感染病[2]。糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）又稱糞腸球菌，也屬于條件致病菌[3]，呈橢圓形、成對或短鏈排列、菌落表面光滑，為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，生存能力較強，在10~45℃的溫度范圍內(nèi)可以正常生長。研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌是腸球菌屬中最常見的病原體，具有較強的致病性，繼鏈球菌和葡萄球菌之后的重要感染病原菌[4-6]。這種病原體會引起各種相關(guān)傳染病，如尿路感染、皮膚軟組織感染、傷口感染、菌血癥、腦膜炎等[7]。

新疆南疆某規(guī)模化羊場在2020年9月出現(xiàn)羔羊陸續(xù)發(fā)病的情況，在15 d之內(nèi)死亡8只，此后發(fā)病不斷。臨床癥狀表現(xiàn)為：初期體溫高達(dá)41~42℃、消瘦、精神沉郁、食欲減少、呼吸困難。肺臟呈彌漫性充血、出血、外觀呈大理石樣；膽囊腫大至原來的2~4倍。本次試驗對新疆喀什地區(qū)某羊場發(fā)病死亡羔羊組織病料中分離出的2株病原菌進行分離鑒定、分子生物學(xué)鑒定，明確了病原菌的藥物敏感性等生物學(xué)特性，確診此次羔羊發(fā)病為金黃色葡萄球菌和糞腸球菌混合感染所致，將為該病的診斷、治療和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2020年9月，在南疆喀什地區(qū)規(guī)?；驁鰺o菌采集8只病死羔羊的肺臟、脾臟、膽囊等組織，將采集的病料分別裝入離心管，存于-80℃冰箱，備用。

1.2 試驗動物

10周齡健康小鼠6只，體重為20~22 g，由塔里木大學(xué)動物實驗站提供。

1.3 試驗試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限 公 司；PremixT aq酶（ExTaq2.0Plus）、DL2000 DNA Marker，均購自TaKaRa公司；BHI液體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

病料采用無菌采集的方法，切成約1 cm3的組織塊，進行涂片、革蘭染色；再將病料置于BHL肉湯培養(yǎng)基中，同時分別將組織病料涂布于LB固體培養(yǎng)基、BHI固體培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18~24 h；多個單菌落被挑取之后進行革蘭氏染色、瑞氏染色，鏡檢觀察。

1.4.2 引物的合成

運用細(xì)菌通用引物擴增金黃色葡萄球菌和糞腸球菌16S rDNA全長序列，16S rDNA基因擴增引物序列及預(yù)計擴增長度見表1。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

表1 16S rDNA基因擴增引物序列及預(yù)計擴增長度Tab.1 16S rDNA gene amplification sequence and expected amplification length

1.4.3 目的基因的擴增

采用細(xì)菌通用的16S rDNA引物進行菌株基因片段擴增，對擴增出與目的條帶相符的部分PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為：DNA模板1μL、2×PCR MIX 12.5μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O 10.5μL，振蕩混勻。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，34個循環(huán)，72℃再延伸10 min。同時，以ddH2O代替模板DNA作為空白對照。反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中，以1×TAE緩沖液電泳，觀察目的條帶，記錄陽性鑒定結(jié)果并拍照保存，進行測序以及分析。

1.4.4 動物致病性試驗

選取6只小白鼠隨機分為對照組、試驗組和攻毒試驗組。分離后挑取單菌落，接種到BHI培養(yǎng)液中，制備成細(xì)菌懸液，攻毒試驗組每只小鼠腹腔注射0.5×108CFU細(xì)菌懸液，0.2 mL/只，對照組注射同劑量的生理鹽水，對死亡的小鼠進行解剖，再將無菌采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等病料做病原的分離與鑒定。

1.4.5 藥敏試驗

選擇氨芐西林、氯霉素、苯唑西林、氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、諾氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、多黏菌素B、萬古霉素等臨床常用的抗生素，將純培養(yǎng)物接種在MH培養(yǎng)基上，使用高壓過后的棉簽涂布均勻，將藥敏片以“花瓣狀”貼于MH培養(yǎng)基內(nèi)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)16~18 h，觀察并測量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果（見圖1~圖6）

將細(xì)菌接種在4種不同的培養(yǎng)基上。由圖1~圖4可知，LB培養(yǎng)基上生長不良；BHI肉湯培養(yǎng)基中出現(xiàn)輕度混濁，形成顆粒狀沉淀；BHI固體培養(yǎng)基上生長良好，形態(tài)為飽滿圓潤、表面光滑、邊緣整齊、半透明的圓形菌落；鮮血培養(yǎng)基上表現(xiàn)為圓形，周圍完全透明的草綠色溶血環(huán)。

圖1 LB固體培養(yǎng)基Fig.1 LB solid medium

圖4 BHI培養(yǎng)基Fig.4 BHI medium

由圖5、圖6可知，挑取單個菌落，進行革蘭、瑞氏染色，鏡檢可見有藍(lán)紫色圓形、卵圓形葡萄狀的金黃色葡萄球菌；橢圓形或圓形鏈狀排列的糞腸球菌。

圖2 BHI液體培養(yǎng)基Fig 2 BHI liquid medium

圖3 鮮血培養(yǎng)基Fig.3 Blood culture medium

圖5 金黃色葡萄球菌革蘭染色鏡檢（10×100）Fig 5 Gram staining microscopic examination of Staphylococcus aureus(10×100)

圖6 糞腸球菌瑞氏染色鏡檢（10×100）Fig.6 Swiss staining microscopic examination of Enterococcus faecalis(10×100)

2.2 16S rRNA PCR擴增結(jié)果（見圖7）

由圖7可知，對初步分離的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示目的片段為1 500 bp，與預(yù)期大小一致。

圖7 16S rRNAPCR擴增結(jié)果Fig.7 16S rRNA PCR amplification results

2.3 16S rRNA基因序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫進行中同源性對比，結(jié)果表明，一株為金黃色葡萄球菌（登錄號為CP-0321601.1），同源性99.93%；另一株為糞腸球菌（登錄號為JN-560903.1），同源性為99.72%，這兩株菌同源性均高于99%，符合判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 動物試驗結(jié)果（見圖8）

注射生理鹽水的兩只小鼠表現(xiàn)為良好的精神狀態(tài)，對照組的小鼠器官均正常，未發(fā)生病理變化。注射細(xì)菌懸液的2只小鼠在12~48 h內(nèi)相繼全部死亡，立即將死亡的小鼠剖解。由圖8可知，與對照組相比，試驗組小鼠心臟有出血點，肝臟腫脹、發(fā)黑，脾臟腫大、軟、紫、紅色，肺臟充血、出血，腎臟質(zhì)脆、變軟、出血。分別取2只小鼠組織進行病原的分離與鑒定及革蘭染色，可見一種為藍(lán)紫色圓形葡萄狀的球菌；另一種為橢圓形或圓形鏈狀排列的球菌，說明這兩種病原菌具有一定毒力，能夠致小白鼠死亡。

圖8 動物試驗解剖Fig.8 Anatomy of animal experiment

2.5 藥敏試驗結(jié)果（見表3）

表3 藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Results of drug sensitivity test

由表3可知，金黃色葡萄球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西林、氨芐西林、氯霉素、苯唑西林產(chǎn)生耐藥性；對氨基糖苷類抗生素慶大霉素、卡那霉素產(chǎn)生耐藥性；對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素表現(xiàn)為高度敏感；對多肽類抗生素多黏菌素B和萬古霉素產(chǎn)生耐藥性；對喹諾酮類抗生素諾氟沙星表現(xiàn)為高度敏感；對四環(huán)素類抗生素四環(huán)素、多西環(huán)素等產(chǎn)生耐藥性。

糞腸球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素氨芐西林高度敏感；對氯霉素、氨芐西林耐藥；對氨基糖苷類抗生素慶大霉素、卡那霉素耐藥；對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素高度敏感；對多肽類抗生素多黏菌素B和萬古霉素敏感；對喹諾酮類抗生素諾氟沙星高度敏感，對四環(huán)素類抗生素四環(huán)素、多西環(huán)素等藥物高度敏感，臨床用藥時可交替使用以上敏感藥物，可達(dá)到有效治療的目的。

3 討論

無菌采集病死羔羊肝臟、肺臟、脾臟等器官組織接種于不同培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)2種致病菌，經(jīng)分離培養(yǎng)、藥敏試驗、動物試驗、16S rRNA基因序列分析，結(jié)果判定2種致病菌分別為金黃色葡萄球菌與糞腸球菌，表明本次引起該規(guī)模化羊場羔羊死亡的主要病原菌為金黃色葡萄球菌與糞腸球菌。

關(guān)于動物感染糞腸球菌的報道很多，但與金黃色葡萄球菌混合感染的報道較少[8]，主要是由于對此情況關(guān)注度不夠高。王亞賓等[9]發(fā)現(xiàn)，由糞腸球菌可引起仔豬關(guān)節(jié)炎，但對致病機理有待進一步研究。齊亞銀等[10]從羔羊中分離鑒定出羔羊腦炎型糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)由于是機會感染菌，其感染途徑可能與溫度、氣候有關(guān)。陳一資等[11]分析了某鴨場暴發(fā)的糞腸球菌病，結(jié)果顯示，養(yǎng)殖場的環(huán)境、飼養(yǎng)條件給糞腸球菌提供了生長環(huán)境，導(dǎo)致疫病暴發(fā)。范輝[12]從雛雞中分離到1株致病性糞腸球菌。金黃色葡萄球菌與糞腸球菌都是環(huán)境中廣泛存在的條件致病菌[13]，羊場中發(fā)病羊為20~30日齡的羔羊，抵抗力較低，同時夏季是細(xì)菌性疾病多發(fā)的季節(jié)，當(dāng)兩種條件致病菌混合感染后，環(huán)境出現(xiàn)變化時，條件致病菌就有機會出動，對羊體造成影響從而發(fā)病。本試驗中的規(guī)?；驁霏h(huán)境良好，可以排除環(huán)境因素，推測由于是機會感染菌，感染途徑可能與氣候、溫度、營養(yǎng)、生殖器官的感染有關(guān)；另外也與臨床上濫用抗生素有關(guān)，其發(fā)病的機理有待一步研究。本次藥敏試驗中，兩種菌均敏感的藥物是卡那霉素、紅霉素、四環(huán)素和諾氟沙星，但混合感染一般不能提前用藥預(yù)防，尤其是環(huán)境出現(xiàn)驟變時難以預(yù)防，在此類混合感染的臨床治療中，應(yīng)合理使用藥物，嚴(yán)禁濫用抗生素，應(yīng)防止多藥耐藥菌株的出現(xiàn)和流行，并應(yīng)加強監(jiān)督和控制。

本試驗表明，喀什地區(qū)部分規(guī)?；驁鲱A(yù)防措施效果不理想，有金黃色葡萄球菌與糞腸球菌的感染情況，還需要加強飼養(yǎng)管理和疾病預(yù)防工作。針對羊場的現(xiàn)狀，建議采取防控措施：在引入動物時，必須進行檢驗和隔離觀察，確認(rèn)羊健康，才能將混群飼養(yǎng)；加強飼養(yǎng)管理，采取防風(fēng)防凍的措施，增強動物自身的抵抗力，也是預(yù)防這種疾病的重要舉措[14]；對未發(fā)病的動物可以用抗生素做預(yù)防性治療，或用疫苗進行緊急接種；此外，提高飼養(yǎng)人員技術(shù)水平是關(guān)鍵，增強飼養(yǎng)人員防控意識，通過進行理論知識的培訓(xùn)從而提高科學(xué)飼養(yǎng)的技術(shù)水平，對治療疾病的技術(shù)進行學(xué)習(xí)培養(yǎng)，可以為疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供基本保證[15]。

4 結(jié)論

本試驗分離鑒定出金黃色葡萄球菌與糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)該羊場發(fā)病羊為2種病原菌混合感染，對其進行藥敏試驗及毒力試驗，對本病提供可行性的防控措施。