曾小林，王 艷，盧加發(fā)，李海鷹，韓 偉

冠心病是全世界死亡的主要原因，以往對心肌梗死的研究大多集中在病因病機(jī)和治療上，對疼痛癥狀本身在發(fā)病機(jī)制上的研究較少。心絞痛是一種內(nèi)臟痛[1]，是一種極其復(fù)雜的病理過程。在臨床上，有一部分心絞痛患者因嚴(yán)重的彌漫性病變、小血管病變、再狹窄以及移植血管橋血栓等原因被排斥在血運(yùn)重建手段之外。針對這些頑固性的心絞痛，其臨床治療效果不佳。已有研究表明，心肌梗死的病人所經(jīng)歷的頻繁的嚴(yán)重的心肌缺血性疼痛與心肌壞死時(shí)大量的P物質(zhì)（Substance P，SP）釋放到心肌內(nèi)有關(guān)[2-3]。Zhang[4]和Guo等[5]研究表明，缺血區(qū)SP的表達(dá)明顯高于非缺血區(qū)。心絞痛疼痛刺激感覺神經(jīng)末梢會(huì)釋放大量的疼痛遞質(zhì)，如SP、降鈣激素基因相關(guān)肽（Calcitonin-Gene-Related Peptide，CGRP）等，可產(chǎn)生神經(jīng)源性反應(yīng)，加重心肌缺血缺氧損傷。急性心肌缺血痛覺干預(yù)，阻斷疼痛因子和介質(zhì)如腺苷A2A受體（Adenosine A2A receptor）和SP受體神經(jīng)激肽1（Neurokinin-1，NK-1）的過度表達(dá)，可能有心肌保護(hù)作用。

心絞痛疼痛主要通過腺苷A1受體傳導(dǎo)，這種作用可通過SP增強(qiáng)[6]。目前已發(fā)現(xiàn)四種腺苷受體（Adenosine Receptors，AR），即腺苷A1、A2A、A2B和A3受體。根據(jù)心血管疾病的解剖分布主要與A1受體和A2A受體有關(guān)。2004年Kelly[7]和Lopes[8]通過Western blot發(fā)現(xiàn)并證實(shí)A2A受體存在于相對較低水平的體感皮層；Ledent[9]研究表明，A2A受體敲除小鼠在熱量測試中表現(xiàn)出低痛覺。因此，我們推測A2A受體可能參與了心絞痛疼痛的過程[10]，但這方面的研究尚未引起重視。這兩種腺苷受體刺激心肌組織的感覺神經(jīng)末梢，神經(jīng)末梢向心肌組織釋放大量的痛因子，如SP、CGRP等，形成一系列的痛反應(yīng)。

本研究采用藥物（拮抗劑）干預(yù)和基因敲除的方法，探討腺苷A2A受體和P物質(zhì)在心肌梗死疼痛中的作用，阻斷兩個(gè)最重要因子的過度表達(dá)，可能具有心臟保護(hù)作用，為心絞痛疼痛干預(yù)提供理論依據(jù)，探索治療心絞痛特別是頑固性心絞痛的新方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國家科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所生命科學(xué)委員會(huì)國家研究所頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》委員會(huì)，所有試驗(yàn)操作遵循動(dòng)物使用相關(guān)倫理要求。實(shí)驗(yàn)在成年C57BL/6J腺苷A2A基因敲除小鼠（Knock Out，KO）和野生型小鼠（Wild-Type C57BL/6J，WT）上進(jìn)行，小鼠體重20～30 g，雌雄不限，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，通過永久性結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支誘發(fā)急性心肌梗死。

1.1.1 分組實(shí)驗(yàn)將36只野生型小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只。3組分別為（1）假手術(shù)組（Sham Group）加生理鹽水（Normal Saline，NS）（Sham Group + NS）；（2）急性心肌梗死模型組加生理鹽水（WT+NS）；（3）急性心肌梗死模型組加L-703606（1 mg/kg/天）（WT+SP）。將24只腺苷敲除小鼠隨機(jī)分為2組，每組12只。兩組分別為（1）急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）模型組加生理鹽水（KO+NS）；（2）AMI模型組加L-703606（1 mg/kg/天）（KO+SP）。所有小鼠均于術(shù)后半小時(shí)腹腔注射0.2 ml生理鹽水，于第14天定時(shí)注射。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器試劑分光光度計(jì)（型號UV-1600）、凝膠文件系統(tǒng)（型號Bio Best 200e）、Trizol（型號Invitrogen Life Technologies）、Realtime PCR Instrument（型號ABI7700）、動(dòng)物呼吸器（型號DHG-30）、心電圖（型號ECG6511）、超聲儀器（型號65l8w）、2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物（型號TTC）、NK1受體拮抗劑（型號L-703606）、SYBR Green I、PCR熱循環(huán)儀。

1.3 建立心肌梗死模型小鼠用氯胺酮100 mg/kg腹腔內(nèi)麻醉，在手術(shù)燈光下用20號靜脈留置針套管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量2～3 ml，通氣頻率90～100次/min。用自制的開胸器開胸，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支近端。術(shù)者觀察到Ⅱ?qū)?lián)立即（Statim/Immediately，ST）段抬高，左室前壁顏色明顯變深灰色或紫色，收縮力減弱或消失，以上特征是造模成功的標(biāo)志。停止機(jī)械通氣直至恢復(fù)自主呼關(guān)胸縫合胸壁。假手術(shù)組也進(jìn)行了同樣的手術(shù)，只是冠狀動(dòng)脈周圍的縫線沒有打結(jié)。

1.4 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）染色取心肌標(biāo)本作冠狀切片，室溫下用2%TTC染色20 min，數(shù)碼相機(jī)拍攝，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正常心肌組織呈鮮紅色，心肌梗死組織呈白色。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試驗(yàn)測定心肌組織IL-1水平分別于術(shù)前24 h、術(shù)后24 h、術(shù)后14天取心肌組織，使用ELISA試劑盒測定心肌組織IL-1水平的表達(dá)。

1.6 福爾馬林疼痛試驗(yàn)術(shù)后第14天，在小鼠左后足底部皮下使用微型注射器注射5%的福爾馬林溶液20 μL后， 立即置于透明的玻璃缸中觀察，實(shí)驗(yàn)過程中避強(qiáng)光，保持環(huán)境安靜，使用數(shù)碼照相機(jī)記錄。以舔注射足時(shí)間為小鼠痛反應(yīng)指標(biāo)。分別記錄小鼠在0～5 min和15～30 min的累積舔足次數(shù)，分別代表I相和Ⅱ相疼痛強(qiáng)度。行為學(xué)觀察采用雙人雙盲法，即觀察者不知道實(shí)驗(yàn)分組的具體情況。

1.7 qRT PCR檢測用TRIzol試劑盒從心肌組織中提取總核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），然后用轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）。根據(jù)試劑盒的說明，使用SYBR進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）?預(yù)混料Ex TaqTMII套件和β-肌動(dòng)蛋白被選為一個(gè)內(nèi)部參考基因。相對定量法（2-△△CT法）計(jì)算目的基因的相對轉(zhuǎn)錄水平，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。SP和β-actin的引物列表，如表1所示。

表1 SP和β-actin的引物列表

1.8 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示±標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Deviation，SD）。正態(tài)性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）比較多組樣本均值。P<0.05，差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建小鼠心肌梗死模型采用開胸結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈前降支建立小鼠急性心肌梗死模型。心電圖結(jié)果，如圖1所示，冠脈結(jié)扎前組正常。急性心肌梗死后1 min和5 min，ST段明顯升高。術(shù)后第14天可見Q波的形成，心臟彩超結(jié)果如圖2所示。顯示術(shù)后14天左室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱，變薄，左室腔變大，射血分?jǐn)?shù)明顯降低。此外，TTC染色結(jié)果，如圖3所示，顯示假手術(shù)組小鼠心肌呈磚紅色；急性心肌梗死模型組為淺白色?；谝陨辖Y(jié)果，我們成功構(gòu)建了小鼠急性心肌梗死模型。

圖1 小鼠急性心肌梗死心電圖結(jié)果

圖2 小鼠急性心肌梗死心臟彩超結(jié)果

圖3 小鼠心肌梗死TTC染色

2.2 腺苷A2A受體敲除及P物質(zhì)對IL-1水平在小鼠心肌組織中的表達(dá)ELISA結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，WT+NS組心肌組織IL-1水平明顯升高；與WT+NS組比較，WT+SP組和KO+NS組心肌組織IL-1水平明顯低于WT+NS組，其中WT+SP組高于KO+NS組。說明阻斷了腺苷A2A受體和P物質(zhì)，IL-1表達(dá)水平明顯下降，如圖4所示。

圖4 ELISA法測定心肌組織的IL-1水平

2.3 福爾馬林疼痛試驗(yàn)福爾馬林刺激模型自Dubuisson和Dennis[11]在1977年建立以來，第I相行為反應(yīng)在刺激后立即出現(xiàn)，持續(xù)約5 min，是直接化學(xué)刺激引起。之后動(dòng)物處于安靜狀態(tài)，稱之為間歇期。第II相行為反應(yīng)在刺激15～30 min,后疼痛反應(yīng)逐漸減退，Ⅱ相是炎癥反應(yīng)所致。福爾馬林Ⅱ期疼痛實(shí)驗(yàn)中，WT+NS與WT+SP比較，小鼠舔體次數(shù)明顯減少（P<0.01）。表明P物質(zhì)阻滯劑能明顯減輕AMI小鼠的疼痛。此外，KO+NS組的舔肉次數(shù)明顯少于WT+NS組（P<0.01），KO+SP組的舔足次數(shù)明顯少于WT+SP組（P<0.05）如圖5所示。結(jié)果證實(shí)了A2A受體敲除后，AMI小鼠的疼痛減輕，而P物質(zhì)阻滯劑能進(jìn)一步減輕A2A受體敲除后小鼠的疼痛。

圖5 福爾馬林實(shí)驗(yàn)

圖6 P物質(zhì)的RT-PCR法定量結(jié)果圖

2.4 腺苷A2A受體敲除和P物質(zhì)對小鼠心肌組織SP表達(dá)的影響 結(jié)果表明，如圖5所示，與假手術(shù)組相比，WT+NS組心肌組織SP的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高；與WT+NS組比較，WT+SP組和KO+NS組心肌組織SP的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，其中WT+SP組高于KO+NS組；KO+NS組和KO+SP組之間沒有明顯差異。

3 討 論

冠心病是危害我國人民身體健康的“頭號殺手”，以往對心肌梗死的研究大多集中在病因病機(jī)和治療上，對疼痛癥狀本身在發(fā)病機(jī)制上的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支成功建立急性心肌梗死模型。在福爾馬林試驗(yàn)中[11]，腺苷A2A受體和P物質(zhì)影響福爾馬林疼痛的Ⅱ期，而不影響Ⅰ期。以往的研究表明，心絞痛主要通過腺苷A1受體，這種作用可被SP增強(qiáng)，而腺苷A2受體的激活通過增加產(chǎn)生促痛或增強(qiáng)疼痛的特性[12]。Ledent[9]研究表明，A2A受體敲除小鼠進(jìn)行了痛覺減退溫度熱試驗(yàn)，與我們福爾馬林試驗(yàn)的結(jié)果相同。福爾馬林試驗(yàn)Ⅱ期為局部炎癥和炎性疼痛物質(zhì)的毒性刺激，提示腺苷A2A受體和SP參與了心絞痛的神經(jīng)源性炎癥；Longhurst[13-14]等提出在心肌缺血疼痛時(shí)存在神經(jīng)源性假說，大量的化學(xué)介質(zhì)刺激心臟感覺神經(jīng)后可能導(dǎo)致心臟傳入通路激活，多種心血管物質(zhì)和神經(jīng)末梢的促炎介質(zhì)釋放，導(dǎo)致“神經(jīng)源性炎癥”反應(yīng)，加重心肌損傷；阻斷疼痛因子的過度表達(dá)可能具有心肌保護(hù)作用。SP是傷害性信息初級傳入的神經(jīng)遞質(zhì)，SP與許多炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子之間相互作用，表現(xiàn)在:（1）SP調(diào)節(jié)多種細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-1、IL-6等炎癥因子;（2）炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞也能刺激SP從外周感覺神經(jīng)末梢分泌，因而在SP與炎癥介質(zhì)之間形成了相互作用的效應(yīng)，使炎癥反應(yīng)的級聯(lián)效應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)測定了IL-1一個(gè)炎癥因子，其中腺苷A2A受體敲除小鼠和P物質(zhì)（WT+SP組）的IL-1表達(dá)最少，進(jìn)一步驗(yàn)證了心絞痛的神經(jīng)源性假說。Gaspardone A[15]研究表明，大量的SP釋放到心肌梗死患者的心肌中出現(xiàn)頻繁的劇烈疼痛，應(yīng)用SP受體（NK-1）拮抗劑CP-99、994明顯減輕術(shù)后疼痛[16]，提示傷害性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的SP是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。我們的結(jié)果表明，阻斷腺苷A2A受體和SP的過度表達(dá)可以減少福爾馬林Ⅱ期舔后爪的次數(shù)，這個(gè)間接提示阻斷疼痛因子的過度表達(dá)可以減少心肌梗死面積。痛覺干預(yù)可減少交感神經(jīng)過度活動(dòng)，減輕疼痛和焦慮，減輕神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)，降低心肌耗氧量，達(dá)到心肌保護(hù)的目的。

5組小鼠的P物質(zhì)的RT-PCR法定量結(jié)果提示，基因敲除小鼠和野生型小鼠加生理鹽水組，SP的表達(dá)有顯著差異；兩組敲除小鼠之間的的P物質(zhì)表達(dá)量無差異，與觀察到福爾馬林試驗(yàn)相符，兩組敲除小鼠在II相期間舔足次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所以我們推測，在急性心肌梗死時(shí)，自身腺苷大量釋放引起劇烈的疼痛，刺激周圍神經(jīng)末梢的P物質(zhì)高度表達(dá)，進(jìn)一步加劇疼痛。而阻斷了腺苷A2A受體的表達(dá)，腺苷釋放明顯減少，這樣P物質(zhì)的表達(dá)也明顯減少，可能與減少IL-1、IL-6等炎癥因子的表達(dá)相關(guān)，如兩者之間具體的相互作用的機(jī)制需進(jìn)一步探討。

綜上所述，我們成功構(gòu)建了急性心肌梗死小鼠模型，腺苷A2A和P物質(zhì)參與了心肌梗死的病理生理過程，阻斷腺苷A2A受體和P物質(zhì)受體神經(jīng)激肽1的過度激活可降低心絞痛的程度，可能有心肌保護(hù)作用。