任云，胡俊平，于虹，顧曉甜

（1.邯鄲學(xué)院化學(xué)化工與材料學(xué)院，河北 邯鄲 056005；2.河北省雜環(huán)化合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056005；3.邯鄲市有機(jī)小分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056005）

核桃（Juglans regia L.）又稱胡桃，是人們?nèi)粘Ｊ秤梅浅Ｆ毡榈母晒?。核桃殼即核桃去仁后的木質(zhì)外殼，質(zhì)地堅(jiān)硬、多孔且無毒，傳統(tǒng)工業(yè)上主要用來作為拋光材料和過濾材料?，F(xiàn)代化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，核桃殼中含多種化合物，包括酚類、苷類、苯丙酸類、酯類、黃酮類等，具有降脂、抗腫瘤等生物活性[1]。何春梅等[2]用超聲輔助提取核桃殼色素中的多酚，利用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析得出核桃殼多酚主要包括酚酸類和黃酮類兩大部分。酚酸化合物中含有咖啡酸和原兒茶酸，黃酮類化合物中檢測到3種化合物含量較高，分別為蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷。核桃殼色素作為天然色素，使用安全，具有一定的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，其色素提取與開發(fā)正成為研究熱點(diǎn)，李維莉[3]按料液比1∶6（g/mL）加入核桃殼粉末和乙醇，控溫80℃，利用超聲波輔助提取2次，用AB-8樹脂進(jìn)行吸附，最后用50%乙醇洗脫，到了核桃殼色素。孫海濤等[4]利用超聲波-微波聯(lián)合輔助提取核桃殼色素多酚，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比為1∶20（g/mL）、超聲功率405W、微波功率200W條件下，提取率達(dá)2.361%。郭瑜等[5]對核桃殼色素提取物的DPPH·、·OH、H2O2和 O2-·的清除率及總抗氧化能力進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核桃殼乙醇提取物及其氯仿相均具有清除自由基和體外抗氧化活性?，F(xiàn)在提取方法多采用超聲或微波輔助，發(fā)揮超聲波振動空化作用及微波高能作用，但微波輔助設(shè)備要求高，不如超聲輔助工業(yè)化易實(shí)現(xiàn)。本文利用超聲輔助提取核桃殼色素，并表征其性能，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供直接數(shù)據(jù)支撐，拓展核桃殼色素在食品、紡織、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。此外提取后的殘?jiān)钥捎糜谄渌I(yè)生產(chǎn)，如制備工業(yè)吸附劑[6-7]，提高核桃殼綜合利用度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

核桃殼：采自河北涉縣；95%乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋁（均為分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；無水硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鉀、抗壞血酸（vitamin C，VC）、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

KO-500DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；800型離心沉淀器：濟(jì)南市醫(yī)療機(jī)械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

通過前期預(yù)試驗(yàn)，核桃殼經(jīng)干燥、粉碎后過40目篩得核桃殼粉。精確稱取核桃殼粉1.00 g，按料液比為1∶10（g/mL）加入提取劑，提取劑為濃度50%的乙醇水溶液，提取溫度50℃，提取60 min，超聲功率500 W。靜置，取上清液，3 000 r/min離心15 min，進(jìn)一步取上清液，稀釋至核桃殼生藥濃度為0.002 g/mL，用紫外可見分光光度計(jì)測得提取液最大吸收波長及其相應(yīng)吸光度。

分別以提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、95%）、提取時間（10、20、30、40、50、60 min）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]作為單因素，考察各影響因素對提取液吸光度的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量為提取溫度、乙醇濃度、提取時間，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。自變量取值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface test factor level

采用Design expert對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到二次回歸方程和誤差分析及各影響因素之間的交互作用，并確定最優(yōu)工藝條件[8]。

取20 g核桃殼粉末，以最優(yōu)工藝進(jìn)行色素提取，所得提取液經(jīng)50℃濃縮、干燥至恒重，研磨得核桃殼色素粉，稱重并按如下公式計(jì)算色素產(chǎn)率。

色素產(chǎn)率/%=（色素質(zhì)量/核桃殼干粉末質(zhì)量）×100

1.2.3 核桃殼色素性能表征

1.2.3.1 金屬離子對核桃殼色素的影響

取蒸餾水將核桃殼色素粉配制成濃度為1.0 mg/mL溶液，分別取8份1.00 mL溶液于25 mL容量瓶中，分別用濃度均為 0.05 mol/L 的 CuSO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、ZnSO4、KCl溶液定容，室溫 20 ℃放置 24 h測定溶液最大吸收波長及吸光度[9]。

1.2.3.2 核桃殼色素對DPPH自由基的清除率

配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，核桃殼色素粉和維生素C分別配制濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL的水溶液。按文獻(xiàn)[10]的方法及公式測定色素及VC的DPPH自由基清除率。

1.2.3.3 核桃殼色素還原力的測定

取核桃殼色素粉和VC分別用蒸餾水配制濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的溶液，取各溶液 2.5 mL于25 mL錐形瓶中，加0.2 mol/L pH6.6磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻于50℃水浴20 min后快速冷卻，加10%三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻后以3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加1 g/L的三氯化鐵溶液2.5 mL搖勻，室溫20℃靜置10 min，于700 nm處測定吸光度[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

核桃殼提取物紫外可見掃描光譜結(jié)果如圖1所示。

圖1 核桃殼提取物紫外可見吸收光譜Fig.1 The ultraviolet absorption spectrogram of walnut shell extract

由圖1可知，在250 nm～350 nm波段掃描核桃殼提取液，測得其最大吸收波長為279 nm，以此為檢測波長，測定提取液吸光度表征色素濃度。

提取溫度對核桃殼提取液吸光度的影響如圖2所示。

圖2 提取溫度對核桃殼提取液吸光度的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on absorbance of walnut shell extract

由圖2可知，提取液吸光度隨著溫度變化先升高后降低，一般而言升高溫度有利于溶出提取，但溫度升高可能會使部分色素分解或聚合形成沉淀。在溫度為50℃時，提取液吸光度到達(dá)最大值，由此確定響應(yīng)面試驗(yàn)提取溫度為40、50、60℃。

乙醇濃度對核桃殼提取液吸光度的影響如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對核桃殼色素吸光度的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the absorbance of walnut shell extract

由圖3可知，提取液吸光度隨著乙醇濃度的變化先減小，后增大，再減小，根據(jù)相似相容原理，最佳提取所需乙醇濃度在50%附近，因此確定響應(yīng)面法試驗(yàn)中乙醇濃度為45%、50%、55%。

提取時間對核桃殼提取液吸光度的影響如圖4所示。

圖4 提取時間對核桃殼色素吸光度的影響Fig.4 Effect of extraction time on absorbance of walnut shell extract

由圖4可知，前30 min內(nèi)吸光度隨著提取時間的增加變化不大，甚至在20 min時出現(xiàn)降低波動，可能原因是提取液還未能完全浸透物料。提取開始20 min后吸光度呈線性增加，應(yīng)是物料完全浸透后提取時間越長，析出色素含量越高。由于色素含量有限，到達(dá)一定時間后，曲線應(yīng)趨于平緩，此試驗(yàn)并未出現(xiàn)吸光度極大值，說明應(yīng)延長提取時間，但繼續(xù)延長時間會降低效率，因此確定最佳提取時間為60 min，響應(yīng)面法試驗(yàn)提取時間為 55、60、65 min。

料液比對核桃殼提取物吸光度的影響如圖5所示。

圖5 料液比對核桃殼提取液吸光度的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the absorbance of walnut shell extract

由圖5可知，提取液吸光度隨溶劑增加變化平緩，表明料液比1∶10（g/mL）時，溶劑已經(jīng)足量，再增加溶劑無助于色素提取且成本增加，減少溶劑則核桃殼粉無法被充分潤濕，因此可固定料液比為1∶10（g/mL），并且料液比不作為響應(yīng)面法試驗(yàn)的影響因素。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

對表2數(shù)據(jù)用ANOVA進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸方程：吸光度=0.54-2.875×10-3A-0.037B+0.018C-0.032AB+3.5×10-3AC+0.025BC-0.030A2+0.024B2+2.25×10-3C2。方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面誤差分析結(jié)果Table 3 Response surface error analysis results

對模型的誤差分析可得：模型P=0.029，差異顯著，失擬誤差P=0.0674為不顯著。其中，AB、A2對核桃殼色素的提取影響顯著；B乙醇濃度對提取液吸光度影響極顯著。主要影響因素順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛r間＞提取溫度。該模型的C.V.=4.69%，說明該模型的置信度良好。該模型的R2adj=0.880 4、R2=0.854 3，說明提取液吸光度的影響85.43%來源于乙醇濃度、提取時間、提取溫度。綜上說明回歸方程模型合理，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，所得模型方程可以預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 響應(yīng)面各影響因素間交互作用

2.3.1 提取時間和提取溫度交互作用

提取時間和提取溫度響應(yīng)面曲線見圖6。

圖6 提取時間和提取溫度響應(yīng)面曲線圖Fig.6 Extraction time and temperature response surface graphs

由圖6可知，此響應(yīng)面變化趨勢平緩，當(dāng)提取時間一定時，吸光度隨著提取溫度增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)提取溫度一定時，吸光度隨著提取時間延長稍有增加。提取時間和提取溫度的交互作用對核桃殼提取液吸光度值影響不顯著，P=0.788 9＞0.05。

2.3.2 乙醇濃度和提取溫度交互作用

乙醇濃度和提取溫度響應(yīng)面曲線見圖7。

圖7 乙醇濃度和提取溫度響應(yīng)面曲線圖Fig.7 Curve of ethanol concentration and temperature response surface

由圖7可見，乙醇濃度在45%附近時，吸光度隨提取溫度增加變化顯著，更有利于提取。乙醇濃度和提取溫度的交互作用對核桃殼色素提取液吸光度影響顯著，P=0.039 6＜0.05。

2.3.3 提取時間和乙醇濃度交互作用

提取時間和乙醇濃度響應(yīng)面曲線見圖8。

圖8 提取時間和乙醇濃度響應(yīng)面曲線圖Fig.8 Curve of response surface of extraction time and ethanol concentration

由圖8可知，提取時間一定時，提取液吸光度隨乙醇濃度增加緩慢降低。乙醇濃度在45%附近時，吸光度隨時間變化不明顯，且此時吸光度較高。乙醇濃度在55%附近時，吸光度隨時間增加而增加，但總體低于45%附近。以上均表明乙醇濃度為顯著影響因素，且其最優(yōu)值應(yīng)在45%附近。提取時間和乙醇濃度交互作用不顯著，P=0.0847＞0.05。

2.4 響應(yīng)面最優(yōu)工藝篩選與驗(yàn)證

用Design expert中Solutions分析，擬定最優(yōu)工藝為乙醇濃度47%、提取溫度51.53℃、提取時間55 min，預(yù)測最佳條件下提取液吸光度為0.613。

結(jié)合實(shí)際工藝操作，確定乙醇濃度47%、提取溫度51℃、提取時間55 min為最優(yōu)提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證，得最佳工藝下提取液吸光度為0.614，色素產(chǎn)率為1.65%。

2.5 核桃殼色素性能表征

2.5.1 金屬離子對核桃殼色素的影響

金屬離子對核桃殼色素的影響如表4所示。

表4 金屬離子對核桃殼色素的影響Table 4 Effect of metal ions on the pigment of walnut shell

由表4可知，加入Fe3+、Cu2+溶液都使原液渾濁，說明這兩種離子對核桃殼色素的結(jié)構(gòu)有所影響；Al3+溶液吸光度較其他離子溶液大，色素溶液顏色加深，但不影響色素應(yīng)用；Mg2+、Na+、Zn2+溶液的加入使得原液的波峰位置偏移，但變化細(xì)微對吸光度及外觀影響可以忽略；Ca2+、K+的加入對原液沒有影響。因此該色素在使用時應(yīng)注意避免接觸Fe3+、Cu2+。

2.5.2 核桃殼色素DPPH自由基清除能力

以VC為對照，核桃殼色素DPPH自由基清除能力如圖9所示。

圖9 DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate

由圖9可知，核桃殼色素對DPPH自由基具有一定清除能力，且濃度越大，DPPH自由基清除能力越大強(qiáng)，但總體較VC弱。在配制濃度為25 μg/mL時清除率已達(dá)臨界值73%，此時實(shí)際溶液體系中核桃殼色素濃度為 12.5 μg/mL，DPPH 濃度為 0.1 mmol/L。

2.5.3 核桃殼色素還原力

以VC為對照，核桃殼色素還原力如圖10所示。

圖10 核桃殼色素還原力Fig.10 Reducing power of walnut shell pigment

由圖10可知，核桃殼色素具有一定還原能力，且濃度越大吸光度越高，則對應(yīng)還原力越強(qiáng)，但總體較VC弱。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，考察了影響核桃殼色素提取液吸光度的主要因素為乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比。結(jié)果顯示：前3個因素對色素提取影響較大。提取時間包含了物料浸潤時間，提取時間應(yīng)大于30 min，料液比對提取影響較小，其可固定為 1∶10（g/mL）。運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，得到影響因素順序?yàn)橐掖紳舛?提取時間>提取溫度，并獲得二次回歸模型，確定最優(yōu)提取條件為乙醇濃度47%、提取溫度51℃、提取時間55 min，此時色素的提取產(chǎn)率為1.65%。利用最佳條件下獲得的色素，測定其對Fe3+、Cu2+、Mg2+、Na+、Al3+、Zn2+、Ca2+、K+等金屬離子穩(wěn)定性，結(jié)果表明，除Fe3+和Cu2+外，其他離子對其影響較小或沒有影響。以VC為對照，測定色素DPPH自由基清除能力和還原力，結(jié)果表明，該色素具有一定的DPPH自由基清除能力和還原能力，但均較VC弱。綜上，核桃殼作為原料提取色素工藝條件易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化并可達(dá)到一定提取產(chǎn)率，所得色素對多數(shù)金屬離子穩(wěn)定且有清除自由基及抗氧化能力。