張黎黎，劉文輝，劉小靜，丁 巖，張 琪，劉 瑜，劉林嶓

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，河南 鄭州 450052)

淚腺良性淋巴上皮病變(benign lymphoepithelial lesion，BLEL)是一種常表現(xiàn)為淚腺無痛性腫大的良性疾病，治療方法以激素為主，還包括放療、手術(shù)等[1]。但激素作用的個(gè)體差異明顯，有些患者接受激素治療的療效并不理想。因此，進(jìn)一步明確BLEL的發(fā)病機(jī)制是十分必要的。本研究基于BLEL基因芯片數(shù)據(jù)，構(gòu)建了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并鑒定其中的關(guān)鍵致樞紐病基因，有助于在分子水平上系統(tǒng)全面明確BLEL的發(fā)病機(jī)制，對BLEL的治療也有一定的啟示作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取本研究選取了Gene Expression Omnibus(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫中編號為GSE76497的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集中包括18例BLEL和作為對照的18例眼眶海綿狀血管瘤。該數(shù)據(jù)集也曾被Adzavon等[2]和Li等[3]用于研究BLEL的發(fā)病機(jī)制，但其研究方法與本研究并不相同。

1.2 差異基因及聚類分析為避免與BLEL發(fā)病關(guān)聯(lián)較弱基因的干擾，本研究利用雙尾Studentt檢驗(yàn)求得了2組的差異表達(dá)基因，取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。在獲得差異基因后，使用Mev軟件[4]對2組進(jìn)行聚類分析，排除異常樣本的數(shù)據(jù)。

1.3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)是基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析的方法構(gòu)建的。WGCNA的方法在Web of Science數(shù)據(jù)庫中被引已經(jīng)超過5 000次[5]，其有效性得到了廣泛的認(rèn)可。不同于常規(guī)的分析方法，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析將基因表達(dá)信息擬合為無尺度網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)特性，將基因網(wǎng)絡(luò)分為若干基因模塊，并從中選擇與表型相關(guān)性最高的關(guān)鍵樞紐基因模塊，進(jìn)一步明確模塊中的關(guān)鍵樞紐基因[6]。構(gòu)建的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)通過Gephi軟件進(jìn)行可視化[7]。

1.4 基因模塊功能注釋利用ClueGo[8]對關(guān)鍵樞紐基因模塊進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)[9-10]和通路分析的注釋，以明確關(guān)鍵樞紐基因模塊的具體功能。GO和通路分析時(shí)，上調(diào)基因和下調(diào)基因分開進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 差異基因及聚類分析共有14 878個(gè)基因在2組中差異表達(dá)，經(jīng)過Mev的聚類分析，差異基因能夠較好將2組樣本區(qū)分開來。其中編號為GSM2027016和GSM2027017的2個(gè)樣本與其他樣本差異較為顯著，提示樣本可能存在異常。為保證下游分析的準(zhǔn)確性，這2個(gè)樣本并未納入下游分析。

2.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)在上述差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了BLEL中基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，因網(wǎng)絡(luò)中基因較多，每個(gè)基因模塊內(nèi)僅取排名最靠前的30個(gè)關(guān)鍵樞紐基因，構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的骨干。BLEL的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)共分為了12個(gè)基因模塊，每一個(gè)基因模塊由一種顏色命名，不能歸類到任何基因模塊的基因均歸類到grey模塊。本研究進(jìn)一步明確每個(gè)基因模塊與BLEL的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，與BLEL相關(guān)性最高的是名為turquoise的基因模塊，相關(guān)系數(shù)為-0.94，對應(yīng)的P<0.001。進(jìn)一步對turquoise模塊內(nèi)的基因進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)，排名靠前的關(guān)鍵樞紐基因分別是MAP1B、DOCK6、RGS5、ESAM和PDE5A。

2.3 基因模塊功能注釋對turquoise模塊中的基因進(jìn)行功能注釋的過程中，上調(diào)基因和下調(diào)基因分開進(jìn)行了分析。Turquoise模塊中上調(diào)基因僅137個(gè)，而下調(diào)基因有5 516個(gè)，因上調(diào)基因數(shù)目過少，并未得到達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的結(jié)果，因此該部分僅報(bào)告下調(diào)基因的結(jié)果。GO分析的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，P值最小的10個(gè)條目均屬于基因本體論中Biological Process的類別，且主要與脈管系統(tǒng)的發(fā)育相關(guān)。通路分析結(jié)果顯示，這些通路主要與細(xì)胞連接和心血管系統(tǒng)相關(guān)。

3 討論

本研究構(gòu)建了BLEL中的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，明確了其中與BLEL相關(guān)性最高的基因模塊及其關(guān)鍵樞紐基因，有助于加深我們對BLEL發(fā)病機(jī)制的理解，這些關(guān)鍵樞紐基因也有可能作為治療BLEL的新的靶點(diǎn)。

本研究首先明確了14 878個(gè)差異基因，這個(gè)數(shù)目比同類研究多。一般而言，類似研究會進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正[11]，目的是減少假陽性，代價(jià)是一部分差異表達(dá)的基因會被過濾掉。為了讓盡可能多的差異基因保留下來，本研究沒有進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正這一步驟。在類似研究中也常常會根據(jù)P值和差異表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行雙重過濾，以挑選出差異表達(dá)顯著的基因。但生物反應(yīng)多是級聯(lián)放大的瀑布式反應(yīng)，推動(dòng)生理病理過程發(fā)展的上游基因往往差異表達(dá)倍數(shù)較下游基因小，而這些上游基因的作用可能比下游基因更重要[12]。因此，本研究也沒有進(jìn)行P值和差異表達(dá)倍數(shù)的過濾。

在構(gòu)建的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，turquoise模塊與BLEL的相關(guān)系數(shù)為-0.94，對應(yīng)的P<0.001，可以看出兩者的相關(guān)性十分顯著。進(jìn)一步的GO分析發(fā)現(xiàn)，與脈管系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的GO條目排名最高。通路分析結(jié)果表明，細(xì)胞連接和血管平滑肌等通路被激活。這些結(jié)果與BLEL的組織學(xué)特點(diǎn)有一定的相關(guān)性，佐證了turquoise模塊與BLEL的相關(guān)性。

Turquoise模塊中排名靠前的關(guān)鍵樞紐基因依次是MAP1B、DOCK6、RGS5、ESAM和PDE5A。進(jìn)一步的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵樞紐基因與BLEL的發(fā)病均具有較強(qiáng)的相關(guān)性。如很多研究證實(shí)IgG4與BLEL發(fā)病具有較強(qiáng)的相關(guān)性[13]，而MAP1B與IgG蛋白表達(dá)具有一定的相關(guān)性[14-15]。BLEL是一種自身免疫疾病，而MAP1B[16]、RGS5[17-18]、ESAM[19]和PDE5A[20]均與自身免疫疾病有較強(qiáng)的相關(guān)性。BLEL的組織中有大量淋巴細(xì)胞浸潤，而MAP1B[21]、ESAM[22]和PDE5A[23]對淋巴細(xì)胞功能均具有重要的調(diào)節(jié)作用。這些關(guān)鍵樞紐基因與BLEL關(guān)系密切，可以作為BLEL治療的潛在靶點(diǎn)。

BLEL組織中有大量淋巴細(xì)胞浸潤，并且可能與淋巴瘤、白血病等并發(fā)[24]，提示其與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的相關(guān)性[25-26]。如MAP1B[27]、RGS5[28]和ESAM[29]均與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。而ESAM[30]、DOCK6[31]和PDE5A[32]與白血病具有一定的相關(guān)性。這些關(guān)鍵樞紐基因與血液系統(tǒng)的相關(guān)性在一定程度上可以部分解釋，BLEL與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的伴發(fā)現(xiàn)象，對血液系統(tǒng)腫瘤藥物的開發(fā)[33]也有一定的提示作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建了BLEL中的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，加深了我們對BLEL發(fā)病機(jī)制的理解，這些關(guān)鍵樞紐基因也可作為治療BLEL的新靶點(diǎn)，對血液系統(tǒng)相關(guān)腫瘤性疾病治療也有一定的啟示。