陳 敏, 劉 茜, 楊曉鳳

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測試中心，成都 610066；2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，成都 610066)

干辣椒是紅辣椒Capsicum annuumL.經(jīng)過自然晾曬、人工脫水等過程而形成的辣椒產(chǎn)品，又稱作辣椒干、干制辣椒等，是世界上用量最大的調(diào)味品。干辣椒的營養(yǎng)價(jià)值很豐富，不僅富含生物活性物質(zhì)辣椒素，還含有多種維生素、膳食纖維、有機(jī)酸、鈣、磷等[1-3]。2017年，中國干辣椒產(chǎn)量世界排名第三 (占比6.79%，印度第一，占比45.31%)，出口量世界排名第二，與排名第一的印度相比存在較大差距 (印度出口量占比55.18%，中國占比21.06%)[4]。究其原因，無論是辣椒品種、產(chǎn)品質(zhì)量、價(jià)格中國都不具備優(yōu)勢[4]。影響產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)重要因素就是農(nóng)藥殘留問題。如：鄒欽培等[3]對2016—2017的某市加工型辣椒農(nóng)藥殘留狀況作了分析，發(fā)現(xiàn)辣椒制品比新鮮辣椒檢出率高，達(dá)到20.67%，郇志博[2]對2016年南方5省150份青辣椒的14種農(nóng)藥殘留做了監(jiān)測分析，農(nóng)藥檢出率為58.0%，不合格率47.3%。農(nóng)藥殘留問題不僅影響辣椒產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展，同時(shí)也威脅人類的生命健康安全。

關(guān)于干辣椒，中國制定了66項(xiàng)農(nóng)藥最大殘留限殘留量 (MRL) 標(biāo)準(zhǔn)，國際食品法典委員會（CAC）制定了78項(xiàng)，印度制定了7項(xiàng)[5-7]。中國制定的66項(xiàng)MRL標(biāo)準(zhǔn)中，有14項(xiàng)是臨時(shí)限量且未指定檢測方法，有28種農(nóng)藥指定用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。本研究整合了CAC、中國、印度關(guān)于干辣椒的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)，通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種快速、高效、準(zhǔn)確地檢測干辣椒中50種農(nóng)藥殘留量的方法，包括GB 2763—2019里指定了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法的28種農(nóng)藥、未指定檢測方法的8種農(nóng)藥 (苯菌酮、氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺、敵草腈、樂果、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺)、指定了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的4種農(nóng)藥 (噻蟲嗪、噻嗪酮、啶酰菌胺、嘧菌酯)，以及CAC和印度有MRL標(biāo)準(zhǔn)而中國無MRL標(biāo)準(zhǔn)的10種農(nóng)藥 (甲萘威、毒死蜱、甲基毒死蜱、滅多威、甲霜靈、滅線磷、三氯殺螨醇、硫丹、三唑磷、喹硫磷)。上述干辣椒中50種農(nóng)藥在中國及其他國家的限量值情況見表1。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干辣椒空白樣品為本單位委托檢測樣品，不含目標(biāo)物。

乙腈、正己烷和丙酮 (色譜純，F(xiàn)isher chemical)；乙酸乙酯和甲苯 (色譜純，TEDIA)；氯化鈉 (分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)。

氟吡菌胺等50種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 (1 000 mg/L，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心)，詳見表1。

表1 干辣椒中待測50種農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The MRLs of 50 pesticides in dry chilli

1.2 主要儀器

TQ8040氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (日本島津公司)；T-18 數(shù)顯高速勻漿機(jī) (德國IKA公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (BUCHI公司)；HCB602H電子天平(0.01 g，艾德姆衡器 (武漢) 有限公司)；朗賦HT2500多管旋渦混合儀 (上海朗賦實(shí)業(yè)有限公司)；Neofuge 18R 高速冷凍離心機(jī) (上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 樣品前處理

樣品制備：依照GB 2763—2019規(guī)定的調(diào)味料制樣方法[7]：準(zhǔn)確稱取500 g干辣椒，全果去柄，粉碎后混勻，于?18 ℃保存，備用。

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取2.0 g (精確至0.01 g) 干辣椒樣品于50 mL塑料離心管中，加入6 mL水渦旋混勻，靜置30 min；加入20 mL乙腈，勻漿2 min后加入5～6 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min后于4 200 r/min下離心5 min；準(zhǔn)確吸取5.00 mL上清液，待凈化。

樣品凈化：用5 mLV(乙腈) :V(甲苯) = 3 : 1混合溶液活化復(fù)合氨基柱后，將待凈化上清液分兩次上樣，用250 mL梨形瓶收集液體；用25 mLV(乙腈) :V(甲苯) = 3 : 1混合溶液分5次淋洗復(fù)合氨基柱，并收集淋洗液；將所有收集到的液體在40 ℃下濃縮至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，即為空白基質(zhì)溶液，待測。

1.4 儀器檢測條件

色譜條件：HP-5 MS色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣 (純度99.999%)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始

溫度50 ℃保持1 min，以25 ℃/min的速率升至200 ℃，再以5 ℃/min的速率升至300 ℃保持5 min；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源 (EI源)；傳輸線溫度300 ℃；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲時(shí)間4 min；多反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將50種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分成兩組，分別準(zhǔn)確吸取1.00 mL于50 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成每種化合物質(zhì)量濃度為20 mg/L的2組混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于 ?18 ℃避光密封保存，備用 (有效期3個(gè)月)。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確吸取20 mg/L的兩組混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液各5.00 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋為質(zhì)量濃度分別為5.0、2.0、1.0、0.5、0.2和0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。于0 ℃避光密封保存，備用 (有效期1個(gè)月)。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取50 μL質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于進(jìn)樣瓶中，加入950 μL空白基質(zhì)溶液，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25和0.5 mg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

吸取上述基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4節(jié)的條件測定。以待測化合物定量離子的峰面積 (y) 為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，非強(qiáng)制過原點(diǎn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到50種農(nóng)藥的線性方程和決定系數(shù)。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng) (Me) 指基質(zhì)對分析物分析過程的干擾和影響。按公式 (1) 計(jì)算。

其中：B為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值；A為純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值。

當(dāng)Me在 ?20%～20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)Me在 ?50%～?20%或20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)Me> 50%或Me< ?50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了HP-5 MS色譜柱和TG-35 MS色譜柱對50種農(nóng)藥響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：酰胺類和菌胺類物質(zhì)在TG-35 MS色譜柱上響應(yīng)差，而在HP-5 MS色譜柱上響應(yīng)均較好，故選擇HP-5 MS色譜柱。

吸取質(zhì)量濃度為5 mg/L 的50種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用全掃描模式進(jìn)行掃描，并通過譜庫對比確定每種農(nóng)藥的保留時(shí)間，選擇響應(yīng)值較高且質(zhì)量較大的2～3個(gè)母離子進(jìn)行碎片離子掃描，選擇豐度值大且特征性強(qiáng)的碎片離子作為其子離子，然后通過能量優(yōu)化確定離子對的能量，每種農(nóng)藥確定3對離子對。選擇響應(yīng)較強(qiáng)的2對離子對，其中響應(yīng)最強(qiáng)的作為定量離子對，另外一對作為定性離子對。

吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 的50種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用優(yōu)化后的MRM參數(shù)測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙酰甲胺磷的離子對136 > 94，噻嗪酮的離子對175.1 > 132.1和175.1 > 117.1，保棉磷的離子對160 > 77和160 > 132，因基質(zhì)干擾不能積分，故乙酰甲胺磷選用136 > 42離子對定量，噻嗪酮選用190 > 175、249 > 193離子對，保棉磷選擇132 > 77和160 > 104離子對。優(yōu)化后的50種農(nóng)藥的GC-MS/MS信息如表2所示。優(yōu)化條件下典型圖譜如圖1所示。

表2 50種農(nóng)藥的GC-MS/MS信息Table 2 GC-MS/MS information of 50 pesticides

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 干辣椒基質(zhì)復(fù)雜，富含維生素、有機(jī)酸、色素。為消除基質(zhì)效應(yīng)，在添加水平0.1 mg/kg條件下比較了丙酮、乙酸乙酯和乙腈3種提取溶劑對提取效果的影響。結(jié)果 (圖2)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)以乙腈為提取溶劑時(shí)，大多數(shù)的農(nóng)藥回收率在90%～105%之間，且提取率均比丙酮和乙酸乙酯高，故選擇乙腈作為提取劑。

2.2.2 稱樣量的選擇 稱樣量的多少會影響試劑用量、后期凈化效果及靈敏度的高低，稱樣量過多，試劑用量多，凈化效果差，但靈敏度高，反之，稱樣量少，試劑用量小，凈化效果相對較好，但靈敏度相對較低[9]。兼顧耗材成本、凈化效果及靈敏度3個(gè)因素，比較了稱樣量分別為2.0、2.5和5.0 g時(shí)對凈化效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有當(dāng)稱樣量為2.0 g時(shí)，復(fù)合氨基柱凈化后色素才基本除盡，且靈敏度可以達(dá)到檢測要求，故稱樣量選擇2.0 g。

2.2.3 凈化方法的選擇 依據(jù)23200.113—2018標(biāo)準(zhǔn)[10]，通過對比試驗(yàn)分析了QuEChERS和固相萃取法兩種凈化方式對回收率和凈化效果的影響。其中固相萃取凈化按1.3節(jié)對樣品進(jìn)行前處理，按1.4節(jié)的條件測定。QuEChERS凈化按23200.113—2018標(biāo)準(zhǔn)的7.1.3節(jié)香辛料方法進(jìn)行前處理[10]。稱取2.0 g (精確到0.01 g) 干辣椒樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻，靜置30 min；加入16 mL乙腈、6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及一顆陶瓷均質(zhì)子，以4 200 r/min離心5 min；取8 mL上清液加入到含有1 200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及200 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min后以4 200 r/min離心5 min；吸取2 mL上清液氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，按1.4節(jié)的條件測定。兩種方法的添加水平均為0.01、0.1和1.0 mg/kg，另設(shè)空白對照。

結(jié)果 (圖3) 發(fā)現(xiàn)：從凈化效果看，固相萃取法的凈化效果明顯優(yōu)于QuEChERS法，原因可能是QuEChERS法在濃縮殘留農(nóng)藥的同時(shí)也濃縮了雜質(zhì)[11]。從回收率看，固相萃取法中50種農(nóng)藥的回收率均可滿足檢測要求，而QuEChERS法中敵草腈、苯氟磺胺、五氯硝基苯、百菌清、嘧菌環(huán)胺、喹氧靈、氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺的回收率不能滿足檢測要求，且大多數(shù)農(nóng)藥的固相萃取法回收率較QuEChERS法高，故選擇固相萃取法凈化樣品。

2.3 方法的線性范圍、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

結(jié)果 (表3) 表明：50種農(nóng)藥中，除甲苯氟磺胺、苯氟磺胺、保棉磷和溴氰蟲酰胺外，其他農(nóng)藥在0.005～0.5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 (R2≥ 0.99)。而甲苯氟磺胺因?yàn)榛|(zhì)干擾，在0.05～0.5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，三氯殺螨醇和苯氟磺胺因不穩(wěn)定，只能檢測出其分解物，其中，苯氟磺胺的分解物只在0.005～0.2 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以10倍信噪比計(jì)算方法的定量限LOQ，干辣椒中50種農(nóng)藥的定量限范圍為0.01～0.1 mg/kg。50種農(nóng)藥中，40種農(nóng)藥為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，2種農(nóng)藥為弱基質(zhì)效應(yīng)，8種農(nóng)藥為中等基質(zhì)效應(yīng)。

表3 50種農(nóng)藥在干辣椒中的線性方程、決定系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)及定量限Table 3 Linear equation, coefficient of determination, matrix effects, and limits of quantitation of 50 pesticides in dry chilli

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

向空白干辣椒樣品中添加0.01、0.1和1.0 mg/kg 3個(gè)水平的50種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)水平重復(fù)5次，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。結(jié)果(表4) 表明：50種農(nóng)藥的回收率為72%～120%，RSD為0.7%～17%，基本滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求[12]。

表4 50種農(nóng)藥在干辣椒中的平均添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Average recoveries and relative standard deviations (RSD) of 50 pesticides in dry chilli

2.5 實(shí)際樣品測定

應(yīng)用本研究建立的方法對采自成都市區(qū)及其周邊農(nóng)貿(mào)市場、超市、批發(fā)市場 (產(chǎn)地來源于云南、四川、貴州、河南、新疆、山東、印度) 的干辣椒樣品共99份進(jìn)行了檢測。結(jié)果 (表5) 顯示：99份干辣椒樣品中，有21份未檢出任何農(nóng)藥 (低于該農(nóng)藥定量限)，占總樣品量的21.2%；有22份檢出1種農(nóng)藥，占總樣品量的22.2%；另外56份均檢出2種以上的農(nóng)藥，其中檢出5種以上農(nóng)藥的樣品有32份，占總樣品量的32.3%。在99份干辣椒樣品中，檢出率較高的農(nóng)藥有：氯氟氰菊酯 (56份)，戊唑醇 (42份)，聯(lián)苯菊酯 (35份)，毒死蜱 (31份)。但根據(jù)GB 2763—2019[7]的限量要求，以單一農(nóng)藥來看，所有有MRL值且有檢出農(nóng)藥的樣品均未超過其MRL值，且低于MRL值較多。由此可見，近年來，中國干辣椒質(zhì)量有較大提高，原因可能是農(nóng)藥在辣椒上施用更加規(guī)范，農(nóng)產(chǎn)品市場監(jiān)管更加到位[13]。

表5 50種農(nóng)藥在99份干辣椒樣品中的檢出情況Table 5 The determination results of 50 pesticides in 99 dry chilli samples

3 結(jié)論

建立了測定干辣椒中50種農(nóng)藥的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。干辣椒樣品加水浸泡后用乙腈提取，再經(jīng)氨基-石墨化碳黑固相萃取柱凈化，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在MRM模式下檢測。該方法的前處理易操作、較環(huán)保且高效，靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析測定要求，可以作為日常檢測干辣椒中多農(nóng)藥殘留量的方法。