李 琦, 于金萍, 郭文磊, 劉亦學(xué)*,, 張 惟

(1. 天津市植物保護(hù)研究所，天津 300381；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640)

薺菜Capsella bursa-pastoris是十字花科薺菜屬草本植物，在中國分布廣泛，其適應(yīng)性強、種子量大、競爭力強，成熟后易傳播，可造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)，是中國小麥種植區(qū)的主要惡性雜草之一[1-2]。近年來，隨著氣候及耕作制度的改變，薺菜已成為天津市冬小麥田主要優(yōu)勢雜草，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]。

乙酰乳酸合成酶 (acetolactate synthase，ALS，EC 4.1.3.18) 在植物體內(nèi)主要催化亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸生物合成的第一階段，以ALS作為靶標(biāo)的除草劑可以通過抑制該酶的活性，使雜草無法合成上述3種氨基酸而死亡[4-6]。鑒于其低毒、高活性和高選擇性的特點，ALS抑制劑類除草劑被長期用于防除麥田雜草，但由于此類除草劑作用位點單一，且長期大面積單一使用，導(dǎo)致其抗性問題十分嚴(yán)重[7]。截至2020年11月，全球已有165種雜草對ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗性[8]。

雜草對除草劑的抗性機理一般分為靶標(biāo)抗性(target site resistance) 和非靶標(biāo)抗性 (non-target site resistance)。靶標(biāo)抗性包括靶標(biāo)酶的過量表達(dá)及其基因突變；非靶標(biāo)抗性則包括雜草對除草劑解毒代謝能力的增強以及吸收轉(zhuǎn)運量的減少等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)雜草對ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的主要原因是由于ALS基因保守區(qū)中的一個或幾個可變氨基酸被其他氨基酸替代所致，目前已經(jīng)報道證實有8個ALS基因氨基酸位點的27種氨基酸替代類型與其抗性相關(guān)[10-11]。

雙氟磺草胺 (florasulam) 是美國陶氏農(nóng)業(yè)科學(xué)公司開發(fā)的一種三唑并嘧啶磺酰胺類 (triazolopyrimidines，TP) 除草劑，屬于ALS抑制劑類，于2001年在我國正式獲準(zhǔn)登記，可防除小麥田大多數(shù)闊葉雜草。小麥?zhǔn)翘旖蚴兄匾募Z食作物之一，薺菜等闊葉雜草在天津市部分地區(qū)的小麥田發(fā)生危害較嚴(yán)重。近年來，天津市部分地區(qū)農(nóng)戶反映雙氟磺草胺對小麥田薺菜防治效果較差，推測薺菜可能對雙氟磺草胺產(chǎn)生了抗性，但其具體抗性水平、抗性機制尚不明確。為此，本研究在天津市靜海區(qū)、武清區(qū)、寶坻區(qū)及薊州區(qū)等薺菜發(fā)生嚴(yán)重區(qū)域的冬小麥田采集部分薺菜種群，測定了其對雙氟磺草胺的敏感性，并擴增、比對了敏感和抗性種群的ALS基因片段，以期為薺菜的有效防除及除草劑的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜草種子：于2018年6月，從天津市靜海區(qū)、武清區(qū)、寶坻區(qū)及薊州區(qū)等地冬小麥田采集薺菜Capsella bursa-pastoris種群共6個，分別編號為TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05和TJ06；另從天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院核心區(qū)內(nèi)未使用過任何除草劑的非耕地采集1個薺菜種群，作為敏感對照，編號TJ12。采集地點等具體信息見表1。

表1 供試薺菜種群采集點信息Table 1 Location of C. bursa-pastoris populations collected

供試除草劑：50 g/L雙氟磺草胺 (florasulam)懸浮劑 (SC)，天津市華宇農(nóng)藥有限公司。

生物試材：植物基因組DNA提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司?；驍U增引物由金唯智 (天津) 生物科技有限公司合成。

主要儀器：ASS-4型自動控制噴灑系統(tǒng)，北京盛恒天寶科技有限公司；5804R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；T100型PCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HDL潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RXZ-280C植物培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；GZX型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薺菜對雙氟磺草胺的抗性水平測定 采用整株水平測定法[12]。從各薺菜種群中選取籽粒飽滿均勻一致的種子，置于含2層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿加5 mL滅菌水保濕，將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中催芽 (光周期：12 h/12 h；溫度：20 ℃/15 ℃)。將15粒露白的薺菜種子均勻播種于直徑12 cm的塑料盆內(nèi)，置于可控溫室中培養(yǎng) (自然光照，溫度20～35 ℃，相對濕度50%～70%)。待生長至2片真葉時間苗，每盆留長勢基本一致的薺菜10株。

待長至3～4葉期，用ASS-4型自動控制噴灑系統(tǒng)進(jìn)行莖葉噴霧。噴霧壓力為0.275 MPa，噴液量450 L/hm2。根據(jù)預(yù)試驗，設(shè)定雙氟磺草胺的處理劑量 (有效成分用量) 分別為：抗性種群 (R)，0、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5、187.5 g/hm2；敏感種群 (S)，0、0.012、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5 g/hm2。每處理重復(fù)3次，試驗共重復(fù)2次。噴藥后21 d，剪取薺菜地上部分，于恒溫干燥箱內(nèi)75 ℃下烘干72 h，稱量干重并記錄。

1.2.2 薺菜ALS基因片段克隆 從薺菜抗性和敏感種群中分別隨機選取20株進(jìn)行基因組DNA提取。待薺菜生長至4葉期后，剪取單株幼嫩葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用已報道的兩對引物序列[13]：Forward 1(5′-ATTCGTCTCCCGATTTGC-3′)/Reverse 1 (5′-GCCCGACACCAGTGCTTAT-3′) 和Forward 2 (5′-GGTATCCCTGTTGCGAGTA-3′)/Reverse 2 (5′-GCATACAAAGACCGTTTA-3′)，用于薺菜ALS基因擴增，其擴增片段包含已報道與抗性相關(guān)的8個基因突變位點。PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括：1 μL基因組DNA模板，1 μL正向引物 (10 μmol/L)，1 μL反向引物 (10 μmol/L)，10 ×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，9.5 μL無核酸酶水。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，34個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，將含目的條帶的PCR擴增產(chǎn)物送金唯智 (天津) 生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序所得序列在NCBI上與薺菜ALS基因進(jìn)行BLAST比對，用DNAMAN 6.0.3軟件對擴增所得敏感、抗性種群薺菜ALS基因進(jìn)行比對分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用雙邏輯非線性回歸模型y=C+ {(D–C)/[1 + (x/GR50)b]} 擬合劑量反應(yīng)曲線，計算出抑制50%薺菜生長所需的除草劑劑量 (GR50值)。式中：y為除草劑某一劑量下薺菜干重相對于空白對照的百分比；x為除草劑劑量；C為劑量反應(yīng)下限；D為劑量反應(yīng)上限；b為斜率。

抗性倍數(shù) (resistance index，RI) 計算公式為：RI = GR50(TJ01-TJ06)/ GR50(TJ12)。式中，GR50(TJ01-TJ06)為抗性種群的GR50值，GR50(TJ12)為敏感種群的GR50值。參考Beckie等[14]的方法對抗性情況進(jìn)行分級：RI < 2為敏感，2 ≤ RI < 5為低水平抗性，5 ≤RI ≤ 10為中等水平抗性，RI > 10為高水平抗性。

試驗結(jié)果采用SPSS 20.0軟件的ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，運用SigmaPlot 12.5軟件繪制劑量反應(yīng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同薺菜種群對雙氟磺草胺的抗性水平

整株水平測定結(jié)果 (表2) 表明，所采集的6個薺菜種群對雙氟磺草胺都產(chǎn)生了高水平抗性，GR50值在5.7～23.6 g/hm2之間，與敏感種群TJ12相比，6個田間種群的抗性倍數(shù)在11.4～47.2之間。

表2 不同薺菜種群對雙氟磺草胺的抗性水平Table 2 Resistance ratio of C. bursa-pastoris to florasulam

2.2 薺菜抗性和敏感種群ALS基因差異

以提取的薺菜敏感和抗性種群單株基因組DNA為模板對ALS基因片段進(jìn)行擴增，得到的兩條ALS基因序列拼接后長度為1 738 bp，與NCBI中薺菜ALS基因序列 (HQ880660.1) 的同源性達(dá)99%以上。擴增的ALS基因片段包含了所有已報道的ALS基因抗性突變位點。將抗性和敏感種群的ALS基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示：在產(chǎn)生抗性的6個薺菜種群中，所有單株的ALS氨基酸序列的第197位氨基酸密碼子均由CCT突變?yōu)榱薚CT，從而導(dǎo)致脯氨酸 (Pro) 突變?yōu)榻z氨酸(Ser) (表3)。對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)6個抗性種群中隨機選取的120個單株所發(fā)生的突變都是雜合型突變 (即197位密碼子為CCT/TCT)。

表3 薺菜抗性與敏感種群ALS基因序列比對分析Table 3 Sequence alignment and deduced amino acid of the resistant and susceptible C. bursa-pastoris populations

3 結(jié)論與討論

通過整株水平測定發(fā)現(xiàn)，采自天津市冬小麥田的6個薺菜種群TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05、TJ06均對雙氟磺草胺產(chǎn)生了高水平抗性，其抗性倍數(shù)在11.4～47.2之間。連續(xù)重復(fù)使用單一作用機制的除草劑是導(dǎo)致雜草抗藥性產(chǎn)生的重要原因[15]。據(jù)報道，ALS抑制劑類除草劑連續(xù)重復(fù)使用3～5年以上，就可導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗性[16]。本研究中，抗性種群采集地塊皆有多年使用雙氟磺草胺防治闊葉雜草的歷史。此外，隨意提高施藥劑量、同一生產(chǎn)季度內(nèi)多次施用具有相同作用機制的除草劑等不合理的施藥方式也加劇了雜草抗藥性的發(fā)生和傳播[17]。據(jù)張樂樂[18]報道，薺菜種子位于土壤表層時最適宜萌發(fā)，隨著埋藏深度增加其萌發(fā)率顯著降低，當(dāng)超過1.2 cm時，萌發(fā)將完全被抑制。因此，在小麥種植前對土壤進(jìn)行適度深耕，可有效降低薺菜的危害。此外，合理選擇不同作用機制的除草劑交替和混合使用也可以延緩雜草抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。

靶標(biāo)酶基因突變是雜草對ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的重要機制。本研究中，產(chǎn)生抗性的6個薺菜種群植株的ALS基因都發(fā)生了Pro-197-Ser突變，已有報道表明，多種雜草因該突變產(chǎn)生了對ALS抑制劑類除草劑的抗性[14]，因此，Pro-197-Ser突變很可能是本研究中薺菜抗性種群對雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性的重要原因。Yu等[19]通過對ALS酶動力學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)Pro-197-Ser突變對ALS功能幾乎沒有影響，不會影響薺菜的正常生理過程，因此這可能是該突變形式在天津廣泛存在的原因之一。張樂樂[18]報道，薺菜的ALS基因中含有2個拷貝，并且這2個拷貝均可發(fā)生抗性基因突變，這可能是導(dǎo)致目前天津發(fā)現(xiàn)的抗性種群突變都是雜合型突變的關(guān)鍵因素。

長期在同一區(qū)域使用相同類型的除草劑，對雜草產(chǎn)生高選擇壓，會加速其抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，而盲目用藥又會進(jìn)一步加劇抗藥性的蔓延。本研究僅從整株水平測定和靶標(biāo)基因突變分析的角度進(jìn)行了研究，下一步還需針對有關(guān)靶標(biāo)酶活性的測定、交互抗性、代謝酶等與抗性關(guān)聯(lián)的其他問題進(jìn)行深入地研究剖析。