張亞偉， 李介巖， 趙 蓉， 郝文靜， 王 欣

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026

2012年起，歐美學(xué)者開始關(guān)注作為動物疾病治療及生長促進(jìn)劑用途的抗生素，可通過食物鏈富集進(jìn)入人體內(nèi)，對于一些特殊人群，比如孕產(chǎn)婦及其嬰幼兒，可能會產(chǎn)生健康影響，特別是對新生兒腸道菌群定植過程可能產(chǎn)生影響[1-5]。此后，國內(nèi)外學(xué)者針對人群食源性抗生素暴露的影響也進(jìn)行了相關(guān)研究[6-11]。在此基礎(chǔ)上，本研究以在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)檢的孕晚期孕婦及其新生兒作為研究對象，通過對孕晚期孕婦血清、臍帶血清及其新生兒胎便的食源性抗生素暴露情況進(jìn)行分析，探討生命體早期食源性抗生素暴露對新生兒腸道菌群的影響，為今后在圍產(chǎn)領(lǐng)域進(jìn)行相關(guān)防治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月至12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)檢的孕晚期(≥36周)孕婦及其新生兒，共計94例，其中樣本收集完整病例共86例。納入標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)律產(chǎn)檢的孕婦(≥36周)及其新生兒；同意本研究知情告知內(nèi)容。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前2個月內(nèi)接受過臨床抗生素治療。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2018-KY-025-02)，所有孕產(chǎn)婦均知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo) 回顧性收集孕晚期孕婦臨床資料，包括年齡、孕周、孕次、分娩方式、產(chǎn)時抗生素使用情況等。

1.3 分組依據(jù) 新生兒的臍帶血被認(rèn)為是研究環(huán)境相關(guān)新生兒疾病較好的生物材料，可準(zhǔn)確反映胎兒在宮內(nèi)的化學(xué)物累積接觸情況，相關(guān)數(shù)據(jù)可用于評估新生兒化學(xué)物暴露的健康風(fēng)險。根據(jù)分娩后新生兒臍帶血樣本的抗生素暴露情況，將其分為對照組(n=43)和抗生素暴露組(n=43)。

1.4 檢測樣本 (1)母體血清樣本取自孕晚期(孕36周及以上)孕婦靜脈血；(2)臍帶血清樣本在新生兒斷臍后15 min之內(nèi)采集；(3)胎便樣本在新生兒分娩之后48 h內(nèi)采集。

1.5 檢測方法 采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography- mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS)和時間分辨熒光免疫層析法(time resolved fluorescent immunochromatography assay，TRFIA)檢測孕婦血清、臍帶血清、胎便中β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、酰胺醇類和林可酰胺類六大類抗生素(共計50種)的暴露情況。這些抗生素均在國內(nèi)經(jīng)濟動物養(yǎng)殖過程中常用，包括32種獸用抗生素(veterinary antibiotics，VAs)，9種獸用/臨床通用抗生素(human/veterinary antibiotics，H/VAs)和9種臨床用抗生素(human antibiotics，HAs)。通過16S rRNA二代測序分析新生兒腸道菌群結(jié)構(gòu)。孕婦靜脈血、臍帶血及新生兒胎便樣本的抗生素檢測由上海溯源生物技術(shù)有限公司完成；新生兒胎便樣本的腸道菌群檢測由卡尤迪生物科技有限公司完成。

1.5.1 UPLC-MS/MS法 UPLC-MS/MS采用Waters公司型號為ACQUITY UPLCH-Class FTN，Xevo TQD的檢測設(shè)備。抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購自中國藥品生物制品檢定所。

取150 μL血清樣本，加入150 μL的4%磷酸溶液，漩渦混勻1 min，取混合液200 μL加入到Oasis HLB μElution Plate小孔中進(jìn)行固相萃取。上樣前，SPE小孔依次用200 μL甲醇和200 μL水(2次，共400 μL水)活化平衡；上樣后用100 μL水沖洗2次后再用抽濾裝置抽干小孔。樣本孔用50 μL、60%乙腈洗脫并抽濾2次至抽干；用96孔收集板收集2次洗脫液，上機待測。

1.5.2 液相條件 色譜柱采用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1×100 mm，美國Waters公司)；柱溫40℃，進(jìn)樣量5 μL，樣品室溫度10℃。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇；流速0.4 mL/min。

1.5.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正負(fù)離子(ESI+/ESI-)切換模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式采集分析，毛細(xì)管電壓分別為3.0 kV+/2.5 kV-，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為550℃，脫溶劑氣流速為1 000 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。

1.5.4 TRFIA法 抗生素檢測試劑盒均由上海溯源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，配套使用上海溯源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SS-030型時間分辨熒光免疫分析儀，抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購自中國藥品生物制品檢定所。

取150 μL稀釋液加入樣本杯，吸打混勻3～5次，再加入10 μL血清樣本，吸打混勻3～5次，插入檢測條，等待反應(yīng)6 min，取出檢測條，將其插入時間分辨熒光免疫分析儀中讀數(shù)。

1.5.5 新生兒腸道菌群檢測 新生兒分娩之后48 h內(nèi)采集新鮮胎便至特定樣本采集管。由卡尤迪生物科技有限公司利用16S rRNA二代測序平臺lllumina MiSeq對胎便進(jìn)行檢測及分析。分別對對照組和抗生素暴露組胎便進(jìn)行腸道菌群α-多樣性分析(包括豐度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、深度指數(shù)、物種信息指數(shù))和多種屬水平的比較。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示：共完整收集86例孕晚期孕婦樣本，年齡24～39歲，孕周36～41周。對照組和抗生素暴露組孕婦的年齡、孕周、孕次、分娩方式差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 孕婦血清、臍帶血清和新生兒胎便中6類抗生素暴露情況 結(jié)果(表2～4)顯示：在排除臨床用藥后，2種檢測方法(UPLC-MS/MS法和TRFIA法)均提示孕晚期孕婦血清、臍帶血清、胎便樣本中抗生素呈現(xiàn)高比例暴露，甚至包括孕期禁用、慎用藥物，且在臍帶血抗生素的暴露比例高于孕婦血清。

表1 2組孕婦一般資料分析

表3 臍帶血清中6類抗生素暴露情況 n(%)

2.3 新生兒腸道菌群檢測結(jié)果 結(jié)果(圖1、圖2)顯示，對照組和抗生素暴露組的新生兒腸道菌群差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？股乇┞妒钩錾笮律鷥耗c道菌群的α-多樣性降低。抗生素暴露使原本屬于優(yōu)勢菌群的糞桿菌屬(Faecalibacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)數(shù)量顯著減少，而鏈球菌屬(Streptococcus)占據(jù)優(yōu)勢。

表4 新生兒胎便中6類抗生素暴露情況 n(%)

圖1 2組新生兒腸道菌群α-多樣性分析

圖2 2組新生兒腸道菌群屬水平差異

3 討 論

19世紀(jì)70年代開始，隨著抗生素制造工業(yè)的飛速發(fā)展，抗生素的應(yīng)用拓展到了畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域。在動物養(yǎng)殖過程中，抗生素作為生長促進(jìn)劑在加快動物生長和增產(chǎn)方面都起到了重要作用[12]。但由于抗生素應(yīng)用時間的延長、應(yīng)用范圍的擴大及抗生素殘留等多種因素，抗生素暴露對人群健康的影響引起研究者的廣泛關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)在20世紀(jì)90年代就基于細(xì)胞毒理學(xué)實驗、動物實驗、離體微生物實驗以及人體研究證據(jù)對食源性抗生素進(jìn)行評價并發(fā)布可接受的每日攝入量(acceptable daily intake，ADI)[13]。近階段研究[14-17]結(jié)果提示，諸如抗生素殘留等環(huán)境污染物的低劑量持續(xù)暴露也可能對于生命體早期生長發(fā)育產(chǎn)生影響。復(fù)旦公共衛(wèi)生學(xué)院研究[18]發(fā)現(xiàn)，青少年兒童體內(nèi)抗生素暴露已成為公共衛(wèi)生問題，是促進(jìn)其脂肪生成的重要因素之一。美國紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院[1]通過一系列實驗證實低劑量抗生素的持續(xù)性暴露干預(yù)了生命體早期的發(fā)育，部分抗生素的影響是終生的、不可逆的。Leclercq等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗生素甚至?xí)π袨楹湍X神經(jīng)化學(xué)造成長期影響。

本研究的研究對象來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科規(guī)律產(chǎn)檢的孕晚期妊娠婦女，在排除臨床用藥后，孕晚期孕婦血清抗生素呈現(xiàn)高比例暴露，甚至包括孕期禁用、慎用藥物，其來源推測以食物攝入為主。同一抗生素暴露在孕婦的不同樣本中，可進(jìn)入胎兒循環(huán)。而且臍帶血中抗生素的暴露比例高于孕婦血清，可能與胎兒器官發(fā)育不完全，這些物質(zhì)進(jìn)入胎兒循環(huán)后無法代謝有關(guān)。

另外，學(xué)者們[20]發(fā)現(xiàn)食源性抗生素的低劑量、持續(xù)性暴露模式有別于臨床抗生素藥物的高劑量、短期暴露，而且食源性抗生素的這種低劑量、持續(xù)暴露模式更多是通過間接影響人體腸道菌群進(jìn)而影響人體健康。已發(fā)表文獻(xiàn)[1-4]亦指出，低劑量抗生素的持續(xù)暴露對于生命體早期人群(胎兒、嬰幼兒)的影響主要是通過影響孕晚期孕婦腸道菌群結(jié)構(gòu)，以及新生兒腸道菌群的定植，從而造成嬰兒腸道菌群成熟延遲、代謝系統(tǒng)紊亂、免疫系統(tǒng)異常，導(dǎo)致其發(fā)生肥胖、過敏等。本研究顯示，抗生素暴露組和對照組的新生兒腸道菌群存在顯著差異。抗生素暴露使新生兒腸道菌群的α-多樣性降低，且使原本屬于優(yōu)勢菌群的糞桿菌屬和瘤胃球菌屬數(shù)量顯著減少，而鏈球菌屬占據(jù)優(yōu)勢。這一結(jié)果表明，食源性抗生素暴露對新生兒腸道菌群結(jié)構(gòu)造成了影響。

綜上所述，食源性抗生素可通過母體間接影響新生兒腸道菌群，進(jìn)而影響嬰幼兒健康。這一結(jié)論給臨床提出了新的挑戰(zhàn)，如何有效干預(yù)食源性抗生素暴露對生命體早期人群(胎兒、嬰幼兒)的影響；進(jìn)行孕晚期血清抗生素檢測，篩查陽性暴露人群，并對該人群實施醫(yī)療干預(yù)(如飲食調(diào)整、益生菌的補充)是否可行，均需進(jìn)一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。