劉偉偉，聶衛(wèi)，崔曉雪，王宏，張婷，劉慶煥，王文彤

腦缺血可引起神經(jīng)元壞死，釋放炎癥介質(zhì)，進而誘導中樞小膠質(zhì)細胞及巨噬細胞為主的外周免疫細胞在缺血區(qū)域聚集并激活，介導腦組織炎癥瀑布效應(yīng)［1］。研究表明，小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化在卒中引起的腦損傷中起關(guān)鍵作用，尤其是M2型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞在促進腦修復(fù)過程中起重要作用［2-3］。復(fù)方景川片為在研的復(fù)方六類新藥，選用紅景天、川芎、延胡索、冰片為組方配伍，諸藥合用，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之效。本課題組前期研究已建立了穩(wěn)定的復(fù)方景川片質(zhì)量評價標準［4］，并證實其可明顯降低腦梗死的面積及神經(jīng)元凋亡程度［5］。但其神經(jīng)保護作用是否與小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化有關(guān)，目前尚不明確。本研究采用大鼠大腦中動脈閉塞模型，觀察復(fù)方景川片在大鼠腦缺血損傷中的神經(jīng)保護作用，并探討其治療作用與小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的相互關(guān)系，旨在探究復(fù)方景川片治療缺血性腦損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK（京）2016-0006，購入后自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃。復(fù)方景川片由天津市醫(yī)藥科學研究所制劑中心提供，規(guī)格0.5 g/片，以紅景天苷計為3.35 mg/g；尼莫地平片，規(guī)格30 mg/片（天津市中央藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號：171102）；2432-A4線栓（北京西濃科技有限公司）。兔抗CD86 多克隆抗體、兔抗精氨酸酶1（Arg1）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），小鼠β-actin 單抗、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）免疫組化染色試劑盒及DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司），蘇木素-伊紅（HE）染液（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。ASP200S 全自動組織脫水機、Leica EG1150H組織包埋機、Leica RM2255全自動切片機（德國徠卡）；尼康Ci-L 圖像采集顯微鏡、NIS-BRML圖像分析系統(tǒng)（日本尼康）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和給藥 60 只大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組，模型組，尼莫地平組和復(fù)方景川片低、中、高劑量組，每組10 只。按成人等效劑量，尼莫地平給藥劑量為0.012 g/kg；復(fù)方景川片低、中、高劑量組分別給予復(fù)方景川片0.78、1.56、3.12 g/kg。造模前7 d 開始各給藥組灌胃給藥，1 次/d，給藥體積10 mL/kg，連續(xù)10 d?？瞻讓φ战M和模型組灌胃等體積純凈水。

1.2.2 動物模型制備 采用Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型［6-7］?？瞻讓φ战M只分離血管，不結(jié)扎不插栓線。模型組、尼莫地平組和復(fù)方景川片中劑量組各有1只大鼠在實驗過程中死亡，予以舍棄。

1.2.3 神經(jīng)行為學評價 （1）神經(jīng)功能評分：造模48 h 后采用Longa 評分法［8］對各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況進行評定，分值0～4分，得分越高，神經(jīng)功能越差。（2）橫木行走實驗：取長1.2 m、寬和高均為2.5 cm的橫木，水平放置于距地面0.6 m處，在末次給藥1 h 后，進行橫木行走實驗［7］，并對其腦缺血損傷后運動行為能力進行評定，橫木行走實驗滿分為6分，得分越高表示運動能力越差。

1.2.4 腦組織處理 造模48 h后，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，迅速斷頭取腦組織，部分新鮮組織低溫凍存，余固定于4%多聚甲醛。固定24 h后冠狀面取材，切取包括大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)在內(nèi)的組織塊，進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為3 μm。

1.2.5 HE染色觀察腦組織病理改變 切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，放入蘇木素染液4 min，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.2.6 免疫組化染色檢測大腦皮質(zhì)CD86和Arg1的定位及表達 常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，滴加體積分數(shù)為3%的H2O2，室溫孵育10 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；微波加熱修復(fù)抗原，用質(zhì)量分數(shù)為50 g/L的牛血清白蛋白封閉20 min；滴加兔抗CD86多克隆抗體或兔抗Arg1多克隆抗體（1∶100），4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后加入生物素化山羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育20 min；PBS 沖洗后加入SABC，37 ℃孵育20 min；PBS 沖洗后加入二氨基聯(lián)苯胺顯色；蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片于光學顯微鏡下隨機讀取3 個視野，采用NIS-BRML 圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析，記錄灰度平均值。

1.2.7 Western blot 檢測腦組織CD86 和Arg1 的蛋白表達水平 各組取3 只大鼠，將缺血皮質(zhì)腦組織切成小塊，加入RIPA 裂解液勻漿、裂解 30 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心5 min，提取樣品中總蛋白，并檢測總蛋白含量。蛋白變性后在10%SDS-PAGE中進行電泳后采用半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉2 h，加入一抗CD86（1∶1 000），Arg1（1∶5 000），置于4 ℃條件下孵育過夜。加入HRP 標記二抗（1∶50 000），使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液，室溫搖床孵育2 h 后洗膜，除去游離二抗。添加ECL 工作液，待熒光帶明顯后，吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X線片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗晾干后掃描膠片。用Imageproplus 軟件分析膠片光密度值，以CD86、Arg1 與β-actin 的光密度比值反映其蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學改變 與空白對照組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分、橫木行走評分均顯著增高（P＜0.05），大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷和行為能力下降。與模型組比較，各給藥組神經(jīng)功能評分、橫木行走評分均顯著降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組神經(jīng)功能評分明顯降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of scores of nerve function and crossbar walking test between the six groups表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和橫木行走實驗評分比較（分，）

Tab.1 Comparison of scores of nerve function and crossbar walking test between the six groups表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和橫木行走實驗評分比較（分，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組比較，c與復(fù)方景川片低劑量組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組復(fù)方景川片低劑量組復(fù)方景川片中劑量組復(fù)方景川片高劑量組尼莫地平組F n 10 9 10 9 10 9神經(jīng)功能評分0.00±0.00 3.22±0.67a 2.60±0.70ab 2.44±0.73ab 1.90±0.57abc 2.11±0.60ab 33.504＊＊橫木行走評分0.00±0.00 4.67±0.87a 3.30±0.82ab 2.89±0.78ab 2.60±0.97ab 3.00±0.87ab 36.571＊＊

2.2 大腦皮質(zhì)病理改變 HE 染色結(jié)果顯示，空白對照組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及毛細血管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰，胞漿無紅染。模型組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元大片消失，錐體細胞明顯減少，細胞間隙增寬，排列紊亂，胞體變小，尼氏小體消失，變性壞死后形成大量空泡，同時可見小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞增生較明顯。各給藥組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)病變減輕，壞死神經(jīng)元減少，正常錐體細胞數(shù)量增多，形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常，細胞核較規(guī)則，仍見小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞增生，水腫較輕，尤以高劑量組和尼莫地平組減輕較明顯，其次為中劑量組和低劑量組，見圖1。

Fig.1 Pathological changes on cerebral cortex of rats in six groups(HE staining,×200)圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)病理改變（HE染色，×200）

2.3 各組免疫組化染色結(jié)果

2.3.1 大腦皮質(zhì)CD86表達及定位 CD86陽性表達為棕黃色或褐色，定位于細胞膜，陽性細胞為小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞?？瞻讓φ战M大腦皮質(zhì)可見CD86少量表達。與空白對照組比較，模型組及各給藥組CD86 表達水平明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組CD86 表達水平降低，其中復(fù)方景川片高劑量組相比中、低劑量組降低較為明顯（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 The expressions of CD86 on cerebral cortex in six groups of rats(immunohistochemical staining,×400)圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)CD86表達（免疫組織化學染色，×400）

2.3.2 大腦皮質(zhì)Arg1 表達及定位 Arg1 陽性表達亦為棕黃色或褐色，定位于細胞漿，陽性細胞為小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞?？瞻讓φ战M僅見極少量小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞表達Arg1。與空白對照組比較，模型組Arg1 表達水平明顯升高（P＜0.05）。各給藥組與模型組比較，Arg1 表達均有所增加，其中尼莫地平組、復(fù)方景川片高劑量組Arg1 表達增加明顯（P＜0.05）；復(fù)方景川片不同劑量組間比較發(fā)現(xiàn)高劑量組較中、低劑量組陽性表達明顯增加（P＜0.05），見圖3、表2。

Fig.3 The expressions of Arg1 on cerebral cortex in six groups of rats(immunohistochemical staining,×400)圖3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Arg1表達（免疫組織化學染色，×400）

Tab.2 Comparison of expression levels of CD86 and Arg1 between six groups of rats表2 各組大鼠CD86和Arg1表達水平比較（灰度值，）

Tab.2 Comparison of expression levels of CD86 and Arg1 between six groups of rats表2 各組大鼠CD86和Arg1表達水平比較（灰度值，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組組比較，c與復(fù)方景川片低劑量組比較，d與復(fù)方景川片中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組復(fù)方景川片低劑量組復(fù)方景川片中劑量組復(fù)方景川片高劑量組尼莫地平組F n 10 9 10 9 10 9 CD86 132.98±8.40 97.75±6.14a 105.26±3.29a 118.59±10.38abc 117.42±5.66abc 112.58±9.60abc 24.639＊＊Arg1 129.04±5.98 113.51±6.35a 110.24±8.18a 110.88±5.49a 100.42±7.01abcd 105.37±6.32ab 21.296＊＊

2.4 各組腦組織CD86、Arg1表達水平比較 Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組及各給藥組大鼠缺血皮質(zhì)腦組織中CD86、Arg1的蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05）。與模型組比較，尼莫地平組及復(fù)方景川片高、中劑量組CD86蛋白表達水平顯著降低，各給藥組Arg1 的蛋白表達水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。復(fù)方景川片高、中劑量組CD86 蛋白表達水平低于低劑量組（P＜0.05），高劑量組Arg1的蛋白表達水平較中、低劑量組明顯增高（P＜0.05），見圖4、表3。

Fig.4 Protein expression levels of CD86 and Arg1 in ischemic cortex of rats圖4 各組大鼠缺血皮質(zhì)CD86、Arg1蛋白表達

Tab.3 Comparison of the protein expression levels of CD86 and Arg1 in ischemic cortex of rats表3 各組大鼠缺血皮質(zhì)CD86、Arg1蛋白表達水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of the protein expression levels of CD86 and Arg1 in ischemic cortex of rats表3 各組大鼠缺血皮質(zhì)CD86、Arg1蛋白表達水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組組比較，c與復(fù)方景川片低劑量組比較，d與復(fù)方景川片中劑量組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組復(fù)方景川片低劑量組復(fù)方景川片中劑量組復(fù)方景川片高劑量組尼莫地平組F CD86/β-actin 0.071±0.006 0.619±0.029a 0.591±0.019a 0.237±0.014abc 0.232±0.017abc 0.301±0.032ab 9.423＊＊Arg1/β-actin 0.083±0.006 0.354±0.011a 0.584±0.009ab 0.483±0.017ab 0.805±0.008abcd 0.728±0.021ab 7.984＊＊

3 討論

缺血性腦損傷屬中醫(yī)學“中風”范疇，多為氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻所致，其中缺血性腦卒中占85%左右，發(fā)病急，病死率高，給患者家庭帶來沉重的負擔。目前西醫(yī)治療缺血性腦損傷尚缺乏切實可行的方法，而中醫(yī)藥用于腦損傷的防治具有獨特的優(yōu)勢［9］。復(fù)方景川片以“益氣活血，化瘀通絡(luò)”為原則，對缺血性腦損傷具有一定的治療作用，可有效改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)行為學功能，減少壞死神經(jīng)元，且隨著給藥劑量的增加，療效更加明顯。

腦卒中后可導致繼發(fā)性腦損傷和多器官功能障礙，而炎癥介質(zhì)失控性釋放是這種改變的基礎(chǔ)［10］。炎癥反應(yīng)在腦缺血病理生理過程中作用復(fù)雜，是一個動態(tài)變化過程。在炎癥反應(yīng)早期或急性期，誘導促炎基因表達，加重組織損傷；炎癥反應(yīng)晚期或亞急性和慢性期，可表現(xiàn)為損傷修復(fù)。從有害作用轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸孀饔玫年P(guān)鍵在于損傷程度和持續(xù)時間，這也成為決定藥物治療時間窗的核心［11］。炎癥微環(huán)境會極大地影響小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的表型變化，從而表現(xiàn)出不同的生物學功能。M1型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞通過 TLR2-Sphk1、Janus 激酶 1/2（JAK1/JAK2）等信號通路，引起白細胞介素（IL）-1β、IL-17、IL-23和腫瘤壞死因子（TNF）-α 釋放，加重腦組織損傷［12］；而IL-4、IL-13等細胞因子可通過激活信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）-6等信號通路促進M2型巨噬細胞表達［13］。M2 型巨噬細胞在大腦恢復(fù)過程中起促進作用，包括神經(jīng)發(fā)生、軸突再生、血管生成、少突膠質(zhì)細胞前體細胞生成和髓鞘再生等［14］。因此，小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的極化狀態(tài)在卒中引起的腦損傷中起關(guān)鍵作用，也是藥物治療的靶點。

CD86是M1型巨噬細胞的分子標志物［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組及各給藥組CD86蛋白表達水平與空白對照組比較明顯增加，表明大腦中動脈閉塞后可觸發(fā)炎性機制，促進M1 型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的活化。各給藥組CD86 蛋白表達水平明顯低于模型組，表明藥物干預(yù)后可降低M1 型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化的程度，減輕了炎性損傷。M2型極化的特征在于高表達 Arg1、CD206、IL-4 等［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組及各給藥組Arg1蛋白表達水平與空白對照組比較明顯增加，表明大腦中動脈閉塞后亦可引起M2型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化；但不同于CD86的表達，模型組中Arg1 蛋白表達水平低于各給藥組，說明藥物干預(yù)后增加了M2 型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化的程度。結(jié)合形態(tài)學觀察，壞死神經(jīng)元數(shù)量減少，正常神經(jīng)元數(shù)目增加，表明藥物干預(yù)促進了M2 型活化，發(fā)揮其抗炎功能，增強神經(jīng)保護作用。尤其復(fù)方景川片高劑量組和尼莫地平組Arg1 蛋白表達水平較模型組和空白對照組明顯增強，表明此兩組M2型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化顯著，與HE染色顯示的腦組織病理改變結(jié)果一致，證實復(fù)方景川片對缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護作用，且作用的發(fā)揮與其對小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的調(diào)控有關(guān)，可在一定劑量范圍內(nèi)抑制M1型極化，促進M2型極化。