區(qū)豪杰，孫嘉，李華宇，董超，劉冰

肺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均位于各種惡性腫瘤之首［1］，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%～85%。肺鱗癌是NSCLC 的亞型之一，約占30%。目前臨床上針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（ALK）等驅(qū)動(dòng)基因的靶向治療藥物對(duì)于肺鱗癌的治療效果始終欠佳，且預(yù)后較差［2］，故亟需研發(fā)治療肺鱗癌的有效藥物。腫瘤凋亡和P53再生化合物（RITA）是一種小分子抗腫瘤藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用［3］。相比傳統(tǒng)化療藥物，RITA 結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)作用時(shí)間更長(zhǎng)，血藥濃度更高［4］。既往研究認(rèn)為RITA 能夠與P53 結(jié)合并增強(qiáng)P53 介導(dǎo)的抑癌效應(yīng)，誘導(dǎo)淋巴瘤［5］、人結(jié)腸癌［6］、慢性粒細(xì)胞白血病［7］等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。更重要的是，RITA能獨(dú)立于P53引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）增多，導(dǎo)致其發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8-9］。目前RITA 對(duì)肺鱗癌細(xì)胞的作用尚少見(jiàn)研究報(bào)道，本研究擬明確RITA對(duì)肺鱗癌細(xì)胞的作用，檢測(cè)其對(duì)ROS產(chǎn)生及其下游信號(hào)的影響以探討其作用機(jī)制，為抗肺鱗癌新藥研發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RITA（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）購(gòu)自MCE公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trypsin-EDTA（0.25%）、Trypsin（不含EDTA，0.25%）均購(gòu)自Gibco公司。苯甲基磺酰氟（PMSF）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、ECL 發(fā)光液購(gòu)自Biosharp 公司。噻唑藍(lán)四唑溴化銨（MTT）、ROS 檢測(cè)探針 DCFH-DA 購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司。Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自貝博生物科技公司。BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific 公司。SDSPAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自Mikx公司。P-Src、Src、轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)換器和激活因子3（Stat3）、P-Stat3、Bim、Mcl-1、Survivin、Bax 及 B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）等一抗抗體購(gòu)自 ABclonal 公司。β-Tubulin 一抗、山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

Fig.1 The structure of RITA圖1 RITA結(jié)構(gòu)

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)購(gòu)自安泰空氣技術(shù)有限公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自力康生物醫(yī)療公司。流式細(xì)胞儀、Multiskan FC全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Scientific公司。冷凍離心機(jī)購(gòu)自Beckman coulter 公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺鱗癌細(xì)胞H226 和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。2 種細(xì)胞均于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，置于37 ℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT 法檢測(cè)RITA 對(duì)H226 和BEAS-2B 細(xì)胞活力的影響。細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，分別用不同濃度RITA（0、0.025、0.05、0.1、0.15 和0.2 μmol/L）處理H226細(xì)胞24 h［7］。以不同濃度RITA（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μmol/L）處理BEAS-2B細(xì)胞24 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔中加入180 μL無(wú)血清培養(yǎng)基和20 μL質(zhì)量濃度為0.5 g/L的MTT溶液，并37 ℃下避光孵育4 h。吸去液體，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀在570 nm 下測(cè)量每孔的吸光度（A）并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）。

1.3.3 ROS 水平檢測(cè) 用DCFH-DA 探針標(biāo)記H226 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。將H226 細(xì)胞接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度RITA（0、0.05、0.1和0.2 μmol/L）干預(yù)12 h。干預(yù)結(jié)束后，培養(yǎng)皿中加入濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA，在37 ℃條件下避光孵育30 min。PBS 重懸3 次，流式細(xì)胞儀以488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行分析。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將H226細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度RITA（0、0.05、0.1 和0.2 μmol/L）干預(yù)處理24 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，用不含EDTA 胰酶消化并收集細(xì)胞。PBS 重懸2 次后，加入Annexin V 結(jié)合緩沖液并在避光條件下用5 μmol/L Annexin V-FITC 孵育15 min，然后加入10 μmol/L 碘化丙啶（PI）避光孵育5 min后上機(jī)分析。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中Src/Stat3 通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將H226細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度RITA（0、0.05、0.1和0.2 μmol/L）干預(yù)處理24 h。給藥干預(yù)結(jié)束后，加入細(xì)胞裂解緩沖液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%蛋白酶抑制劑混合物獲得全細(xì)胞提取物。采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取50 μg 蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電泳：恒壓80 V，20 min。分離膠電泳：恒壓120 V，60 min。330 mA 恒流轉(zhuǎn)膜30 min 后，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h。P-Src、Src、Stat3、P-Stat3、Bim、Mcl-1、Survivin、Bax、Bcl-2 及β-Tubulin 一抗（均1∶1 000 稀釋?zhuān)┓謩e在4 ℃下孵育過(guò)夜，山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000稀釋?zhuān)┓跤? h，使用ECL發(fā)光液顯色。使用Image J 分析軟件對(duì)目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值進(jìn)行分析。

1.3.6 NAC 對(duì)RITA 處理的細(xì)胞中ROS、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將H226 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為空白對(duì)照組、5.0 mmol/L NAC 組、0.2 μmol/L RITA 組、0.2 μmol/L RITA 與 5.0 mmol/L NAC［10］聯(lián)合用藥組。分組處理12 h 后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量；24 h 后檢測(cè)細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白的表達(dá)，檢測(cè)方法同1.3.3～1.3.5。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7.01進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)重復(fù)3 次并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RITA 對(duì) H226 細(xì)胞、BEAS-2B 細(xì)胞活性的影響 MTT 結(jié)果顯示，0.05～0.2 μmol/L RITA 可抑制H226 細(xì)胞增殖活性，半抑制濃度（IC50）為（0.130±0.008）μmol/L（圖2A）；而在相同濃度條件下，RITA對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 增殖無(wú)明顯抑制作用（圖2B）。

Fig.2 The effect of RITA on the survival rates of H226 and BEAS-2B cells圖2 RITA對(duì)H226和BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響

2.2 不同濃度RITA 對(duì)H226 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響 0～0.2 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著RITA 的升高，H226細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，見(jiàn)圖3。

Fig.3 The effect of RITA on ROS activity in H226 cells圖3 RITA對(duì)H226細(xì)胞內(nèi)ROS活性的影響

2.3 RITA對(duì)H226細(xì)胞Src/Stat3通路相關(guān)蛋白表達(dá)及凋亡的影響 Western blot 結(jié)果顯示，隨著RITA濃度的升高，H226 細(xì)胞中 P-Src、P-Stat3 水平下降，抗凋亡蛋白Mcl-1、Survivin、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bim、Bax 表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率升高，見(jiàn)圖4、5，表1。

Fig.4 The changes of Src/Stat3 pathway and apoptosis-related protein expression in H226 cells after RITA treatment圖4 RITA處理后H226細(xì)胞內(nèi)Src/Stat3通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Fig.5 RITA induced the cell apoptosis of H226 cells圖5 RITA誘導(dǎo)H226細(xì)胞凋亡

Tab. 1 Comparison of expression levels of Src/Stat3 pathway and apoptosis-related proteins in H226 cells treated with RITA表1 經(jīng)RITA處理后的各組H226細(xì)胞內(nèi)Src/Stat3通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，%，）

Tab. 1 Comparison of expression levels of Src/Stat3 pathway and apoptosis-related proteins in H226 cells treated with RITA表1 經(jīng)RITA處理后的各組H226細(xì)胞內(nèi)Src/Stat3通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a與0 μmol/L組比較，b與0.05 μmol/L組比較，c與0.1 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組0.05 μmol/L組0.1 μmol/L組0.2 μmol/L組F P-Stat3 100.00±1.04 65.69±9.37a 19.25±4.61ab 7.67±2.55abc 125.000＊＊Stat3 100.00±6.86 100.26±2.42 102.96±2.33 102.49±2.74 0.278 P-Src 100.00±3.72 94.85±1.96 86.30±5.27a 56.55±13.30abc 13.580＊＊Src 100.00±12.91 102.38±2.63 104.75±1.49 102.83±4.94 0.152 Bim 100.00±12.22 159.18±11.23a 248.13±24.81ab 310.93±19.83abc 54.420＊＊Mcl-1 100.00±5.60 84.89±8.97 74.86±6.42a 62.41±1.98ab 12.880＊＊Survivin 100.00±13.51 65.94±8.37a 46.06±5.45ab 26.51±4.63abc 25.900＊＊Bax 100.00±4.73 147.23±5.99a 195.42±15.55ab 255.15±19.18abc 52.840＊＊Bcl-2 100.00±7.75 75.79±6.22a 52.32±2.92ab 37.05±3.41abc 51.100＊＊

2.4 NAC 對(duì) RITA 引起 H226 細(xì)胞內(nèi) ROS 上升的影響 RITA（0.2 μmol/L）與NAC（5.0 mmol/L）同時(shí)給藥干預(yù)12 h 后，NAC 能夠有效地逆轉(zhuǎn)RITA 引起H226細(xì)胞內(nèi)ROS的上升，見(jiàn)圖6。

Fig.6 NAC decreased the increase of ROS caused by RITA in H226 cells圖6 NAC減少RITA引起H226細(xì)胞內(nèi)ROS的升高

2.5 NAC 對(duì) RITA 抑制 Src/Stat3 通路活性及誘導(dǎo)H226 細(xì)胞凋亡的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與RITA 組相比，RITA＋NAC 干預(yù)后，P-Src、P-Stat3 及抗凋亡蛋白Mcl-1、Survivin、Bcl-2表達(dá)水平增高，促凋亡蛋白Bim、Bax 的表達(dá)水平減少，見(jiàn)表2、圖7。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAC 能夠逆轉(zhuǎn)RITA 誘導(dǎo)的H226細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖8。

Tab.2 Comparison of protein expression results related to apoptosis rate of H226 cells in each group表2 各組H226細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果比較 （n=3，%，）

Tab.2 Comparison of protein expression results related to apoptosis rate of H226 cells in each group表2 各組H226細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果比較 （n=3，%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較；b與NAC組比較，c與RITA組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組NAC組RITA組RITA+NAC組F P-Stat3 100.00±6.10 93.81±3.08 14.25±2.06ab 32.71±1.50abc 279.700＊＊Stat3 100.00±13.65 102.95±0.98 102.98±2.97 103.06±4.32 0.084 P-Src 100.00±12.59 93.62±8.19 35.28±4.95ab 70.88±12.52c 16.820＊＊Src 100.00±8.49 96.98±8.04 102.91±6.16 103.25±5.24 0.339 Bim 100.00±4.64 120.86±9.31 262.26±36.69ab 120.99±5.71c 9.492＊＊Mcl-1 100.00±18.45 95.23±4.51 47.20±7.87ab 101.34±5.70c 11.840＊＊Survivin 100.00±2.17 99.74±3.69 63.78±3.32ab 100.69±7.77c 29.470＊＊Bax 100.00±16.43 91.72±11.93 157.33±25.37ab 97.81±11.58c 6.297＊Bcl-2 100.00±26.15 95.39±4.16 55.10±2.37ab 82.43±8.84c 4.148＊

Fig.7 NAC reversed the changes of Src/STAT3 pathway and apoptosis-related protein expression induced by RITA in H226 cells圖7 NAC逆轉(zhuǎn)RITA對(duì)H226細(xì)胞Src/Stat3通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig. 8 NAC reversed RITA induced apoptosis of H226 cells圖8 NAC減少RITA誘導(dǎo)H226細(xì)胞的凋亡效應(yīng)

3 討論

臨床上治療肺鱗癌多以化療為主，而針對(duì)EGFR、ALK 和ROS1等驅(qū)動(dòng)基因的靶向藥物的治療效果始終不佳［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，RITA 對(duì) H226 細(xì)胞具有良好的抑制作用，而在相同濃度條件下，RITA對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 增殖無(wú)明顯抑制作用，提示RITA 對(duì)肺鱗癌細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，可能是治療肺鱗癌的潛在藥物。

既往研究發(fā)現(xiàn)，RITA 除了激活P53 蛋白表達(dá)外，還能引起細(xì)胞內(nèi)ROS 上升，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［8-9］，均提示氧化應(yīng)激可能是RITA 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要潛在機(jī)制。ROS 作為信號(hào)分子參與許多癌癥生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡等。與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞通常具有較高的ROS 水平，這對(duì)于癌細(xì)胞增殖及凋亡抵抗起著重要作用［12］。此外，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 的改變更為敏感［13］。腫瘤細(xì)胞內(nèi) ROS 的顯著增加會(huì)破壞氧化還原平衡，從而引起細(xì)胞損傷，持續(xù)的損傷最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)ROS平衡可能是治療癌癥的有效途徑。NAC是經(jīng)典的抗氧化劑，可有效消除細(xì)胞內(nèi)ROS［14］。本研究結(jié)果表明，在0～0.2 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著 RITA的升高，H226 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平上升，細(xì)胞凋亡率增加。與單獨(dú)給藥RITA 相比，RITA 與NAC 聯(lián)用后，H226細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示RITA 可能通過(guò)促使H226 細(xì)胞內(nèi)ROS 的失衡，從而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)凋亡。這可能是RITA抗腫瘤的一個(gè)新的作用機(jī)制。

細(xì)胞內(nèi)ROS 水平失衡可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制 Src/Stat3 通路活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15-16］。因此細(xì)胞內(nèi)過(guò)多ROS的產(chǎn)生在抑制Src/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。Src 是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，其廣泛存在于組織細(xì)胞中，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展；而Stat3是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也是Src靶向調(diào)節(jié)的下游細(xì)胞因子［17］。Src/Stat3通路是調(diào)控癌癥細(xì)胞增殖和生存的重要細(xì)胞信號(hào)，激活的Stat3蛋白最終傳遞到細(xì)胞核，促進(jìn)Survivin 和Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄、翻譯，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用［18］。更重要的是，Src/Stat3通路的激活會(huì)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞增殖、抗凋亡、產(chǎn)生耐藥和轉(zhuǎn)移等一系列生物效應(yīng)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，RITA 可呈劑量依賴(lài)性減少 P-Src、P-Stat3，降低抗凋亡蛋白Mcl-1、Survivin、Bcl-2 的表達(dá)及增加促凋亡蛋白Bim、Bax 的表達(dá)，并伴隨肺鱗癌細(xì)胞凋亡的增加。使用NAC后，RITA抑制Src/Stat3通路活性及誘導(dǎo)H226 細(xì)胞凋亡的效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)，表明RITA通過(guò)引起ROS 水平上升，進(jìn)而抑制Src/Stat3 通路活性。

綜上所述，RITA 通過(guò)引起肺鱗癌H226 細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，從而產(chǎn)生細(xì)胞氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被打破，進(jìn)一步抑制Src/Stat3 信號(hào)通路激活，最終誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞凋亡。