楊曉莉，唐延?xùn)|，張方東，裴繼誠

(天津市制漿造紙重點實驗室，天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

活性氧(ROS)是氧通過單電子還原產(chǎn)生的一類含氧且化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)，主要包括羥基自由基、烷氧自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫等自由基與非自由基物質(zhì)，其中羥基自由基和超氧陰離子自由基的數(shù)量最多、分布最廣泛、攻擊性最強[1].活性氧的產(chǎn)生與紫外光老化有關(guān)，紫外線照射產(chǎn)生的 ROS會攻擊磷脂雙分子層、核酸和細(xì)胞器，造成細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致皮膚衰老[2].過多的ROS還會引發(fā)血管疾病、阿茲海默癥、癌癥等疾病，因此，清除多余的ROS很有必要[3-5].研究表明：使用外源性自由基清除劑二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、維生素 C(VC)等可有效清除 ROS，但 BHT和 BHA這類化學(xué)合成的自由基清除劑溶解性受限，且長期使用可能會對健康造成危害[6]；VC是天然高效自由基清除劑，但具有光敏性，暴露在光照下刺激皮膚且容易失效.因此，尋找安全、高效的天然自由基清除劑成為趨勢.

殼寡糖(COS)主要來源于蝦蟹殼等海洋資源，是世界上最豐富的可再生資源之一，它由 β-(1-4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖單體組成，分子鏈上有較為活潑的—OH及—NH2基團，易發(fā)生氧化、醚化、季銨化和烷基化等反應(yīng)[7].同時，殼寡糖具有生產(chǎn)成本低、無毒非致敏性、溶解性好等優(yōu)良特點[8-9]，還具有抗菌、抗肥胖、抗炎癥等功能，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[10].因此，通過改性殼寡糖提高其性能及開發(fā)新功能產(chǎn)品成為研究熱點之一.

6-羧基殼寡糖(C-COS)作為一種殼寡糖改性后得到的水溶性衍生物，其分子骨架含有大量陰離子和陽離子基團.近年來，本課題組對 C-COS的保濕性、抗黑色素沉積及抗菌性能進行研究[11-12]，但對 ROS的清除能力尚未系統(tǒng)研究.有實驗表明，殼寡糖相對分子質(zhì)量大小和脫乙酰度對清除自由基具有重要影響，相對分子質(zhì)量越小、脫乙酰度越高的殼寡糖具更好的清除自由基效果[13].此外，有報道[14-15]指出 O-羧甲基殼聚糖和 N-羧甲基殼聚糖相比殼聚糖具有較高的抗氧化活性，表明羧甲基基團的出現(xiàn)提高了殼聚糖的抗氧化活性，這對選擇 6-羧基殼寡糖(C-COS)清除ROS提供重要研究思路.

本文選擇低相對分子質(zhì)量、高脫乙酰度的殼寡糖為原材料，用一種綠色環(huán)保的方法將殼寡糖 C6伯羥基(—OH)氧化成羧基(—COOH)，制備出 6-羧基殼寡糖(C-COS)，并采用紅外光譜、核磁共振等方法對6-羧基殼寡糖進行表征.通過體外實驗探究 6-羧基殼寡糖清除 ROS的能力，并與殼寡糖及 VC進行對比.根據(jù)實驗結(jié)果并結(jié)合自由基產(chǎn)生途徑，對清除ROS的機理進行分析.

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

漆酶，酶活 1072U/mL，諾維信生物技術(shù)有限公司；殼寡糖，相對分子質(zhì)量約為 1000，脫乙酰度90.5%，上海源葉生物科技有限公司；2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)，Sigma-Aldrich 公司；其他試劑及溶劑純度為分析純.

N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化儀器有限公司；VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司；AVANCE Ⅲ400型核磁共振波譜儀，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司；AT-510型自動電位滴定儀，日本京都電子工業(yè)株式會社；UV-2550型紫外分光光度計，日本島津公司.

1.2 制備方法

取 0.08g 2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)溶于 250mL pH＝4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加入4g殼寡糖充分?jǐn)嚢?，放?0℃水浴鍋中反應(yīng) 15min；添加 0.4mL漆酶，進行持續(xù) 18h的通氧反應(yīng)；通氧結(jié)束后調(diào)節(jié)反應(yīng)液至中性；將反應(yīng)液進行旋蒸，旋蒸至 15mL時，轉(zhuǎn)移至燒杯中并加入300mL無水乙醇，靜置 60min；待反應(yīng)產(chǎn)物析出后，進行真空抽濾，反復(fù)醇洗過濾產(chǎn)物至醇洗液澄清；將濾餅放置真空干燥箱 40℃烘干 48h，烘干后研磨得樣品粉末.

1.3 表征方法

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)檢測

稱取干燥的0.001g樣品和0.1g溴化鉀，在瑪瑙研缽中快速充分研磨后壓片 1min，以空氣作為采樣背景，將壓好的樣品立刻放入紅外光譜儀中進行掃描.設(shè)定掃描范圍為 400～4000cm－1，分辨率為4cm－1，掃描次數(shù)為 32次.

1.3.2 核磁共振(13C NMR)檢測

稱取150mg樣品溶于0.55mL的D2O中，設(shè)置采樣條件為30°脈沖序列，掃描時間1.36s，弛豫時間1.89s，累積掃描1024次.

1.3.3 酸堿電導(dǎo)滴定檢測

稱取0.2g樣品，溶于10mL 0.1mol/L的HCl溶液中進行酸化，溶解后再加入 90mL水稀釋，靜置待測.打開自動電位滴定儀，使用 0.1mol/L的 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，記錄 NaOH的消耗體積和電導(dǎo)率，通過式(1)計算出樣品的羧基含量.

式中：V1、V2和 V3、V4分別為殼寡糖溶液和樣品溶液滴定曲線的計量點，代表 NaOH 的消耗體積，mL；c為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；m 為樣品質(zhì)量，g；45為羧基的相對分子質(zhì)量.

1.4 清除ROS能力的檢測

1.4.1 羥基自由基的清除

FeSO4與 H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，·OH 越多，生成紫色顏色越深.參考 Zhang等[16]的方法，實驗設(shè)樣品組、空白組、對照組.樣品組：添加 2mL 6mmol/L的 FeSO4溶液和 2mL 6mmol/L的 H2O2溶液后，再分別添加2mL不同濃度的樣品溶液(6-羧基殼寡糖溶液、殼寡糖溶液、抗壞血酸溶液)，靜置 10min，加入 2mL 6mmol/L的水楊酸溶液搖勻，37℃溫水浴 30min，5000r/min離心5min，取上清液于波長510nm處測其吸光度.用蒸餾水代替樣品為空白組，用蒸餾水代替水楊酸為對照組.按照式(2)計算·OH的清除率.

式中：I表示清除率，%；A為樣品組吸光度；Ai為對照組吸光度；A0為空白組吸光度.

1.4.2 過氧化氫的清除[17]

用 100mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制20mmol/L過氧化氫(H2O2)溶液.取 3組試管，分別添加l mL不同濃度的6-羧基殼寡糖樣品液、殼寡糖樣品液、抗壞血酸樣品液，同時各加入 2mL H2O2均勻混合，避光 10min后用紫外分光光度計測定其在230nm處的吸光度.用蒸餾水代替樣品液為空白組，用蒸餾水代替 H2O2為對照組.按照式(2)計算 3種樣品液對過氧化氫的清除率.

1.4.3 烷氧自由基的清除[18]

鐵離子可誘導(dǎo)脂質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)生烷氧自由基(RO·)，在加熱情況下硫代巴比妥酸(TBA)與過氧化物產(chǎn)生紅色化合物.脂質(zhì)體 PBS分散體系(LLS)的配制：用PBS溶液(0.01mol/L、pH 7.4)溶解 30mg卵磷脂配制 10mg/mL的溶液，標(biāo)記為 LLS待用.取 100mL燒杯，依次加入 40mL蒸餾水、15g三氯乙酸(TCA)、0.37g硫代巴比妥酸(TBA)、2mL的濃HCl，攪拌至溶解后移液至 100mL容量瓶并用蒸餾水定容，標(biāo)為 TCA-TBA-HCl.向試管中依次加入1mL LLS、1mL 400μmol/L FeCl3、1mL 不同濃度的樣品溶液，混勻后放置暗室 37℃水浴 1h，再加入2mL配制完成的TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴 15min，水浴結(jié)束后置于冰水冷卻，混合液在4000r/min條件下離心 10min，測定上清液在波長532nm處的吸光度.用蒸餾水代替樣品液為空白組，用蒸餾水代替 TCA-TBA-HCl為對照組，按式(2)計算3種樣品液對烷氧自由基的清除率.

1.4.4 超氧陰離子自由基的清除

鄰苯三酚在堿性條件下可生成有色的中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基()，產(chǎn)物顏色越深代表超氧陰離子自由基生成越多，可用分光光度法進行檢測.參考Acker等[19]的方法取3組試管分別加入0.5mL不同濃度的 6-羧基殼寡糖樣品液、殼寡糖樣品液、抗壞血酸樣品液，再均加入6mL Tris-HCl(50mmol/L，pH 8.1)緩沖溶液，混勻后 37℃水浴處理 10min，然后各加入 lmL經(jīng) 37℃預(yù)熱過的鄰苯三酚鹽酸溶液(7mmol/L)，搖勻，精確反應(yīng) 4min后加 0.5mL濃HCl終止反應(yīng)，在 325nm 波長處測定吸光度.用蒸餾水代替樣品液為空白組，用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液為對照組，按照式(2)計算 3種樣品溶液對·O2-的清除率.

1.5 螯合亞鐵離子能力的檢測[20]

取 1mL 5mmol/L COS、C-COS溶液分別與0.05mL 2mmol/L 的 FeSO4溶液混合，靜置 3min，然后加入 0.1mL 5mmol/L菲洛嗪溶液，37℃靜置15min 使反應(yīng)達(dá)到平衡后測定在 562nm 處的吸光度.用蒸餾水代替樣品溶液為空白組，用蒸餾水代替FeSO4溶液為對照組.通過式(3)計算COS與C-COS兩種溶液螯合Fe2+的能力.

式中：R表示螯合能力，%；A0為空白組吸光度；A為樣品組吸光度；Ai為對照組吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征分析

2.1.1 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

殼寡糖(COS)和 6-羧基殼寡糖(C-COS)的紅外光譜如圖1所示.由圖1可知：兩者出峰位置大致相同，在 3400cm-1至 3200cm-1處，C-COS比 COS的吸收譜帶明顯變寬，說明 C-COS的—OH與—NH2強度增加；2880cm－1和 2930cm－1處為 C—H 的伸縮振動峰，主要代表了 C6位的亞甲基和 C2位所連接的乙酰氨基上的甲基；1640cm－1的 N—H彎曲振動峰仍然存在，說明兩者均殘留部分乙酰胺基；CCOS的 1600cm－1與 1410cm－1處出現(xiàn)了新的較為明顯的C＝O不對稱伸縮振動吸收峰[21]，說明殼寡糖氧化后新生成了羧基或醛基.

圖1 COS與C-COS的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of COS and C-COS

2.1.2 核磁共振(13C NMR)分析

COS與 C-COS溶于 D2O后所得的核磁共振(13C NMR)譜圖如圖2所示.由圖2可知：圖中共有6處較為明顯的共振峰，從左往右依次位于化學(xué)位移101.35、76.54、74.66、72.04、60.16 和 55.52 處，分別代表 COS 與 C-COS 結(jié)構(gòu)上的 C1、C4、C5、C3、C6和 C2[22]，表明 COS與 C-COS的吡喃環(huán)未被破壞；COS與C-COS分別在化學(xué)位移174.78處和174.38處出現(xiàn)較強共振峰，代表COS與C-COS存在部分乙酰氨基(CH3CONH—)[23]；COS、C-COS 在化學(xué)位移181.61處出現(xiàn)了新的共振峰，與羧酸根(—COO-)的共振峰在 170～190范圍內(nèi)相吻合[24]，證明產(chǎn)生新的羧基官能團.綜上所述，鑒于吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)未破壞，C3位仲羥基不能被氧化，C6位伯羥基依然存在，又有新官能團羧基的出現(xiàn)，溶液中又有 Na+存在，推斷出漆酶/TEMPO體系是將殼寡糖部分C6位伯羥基氧化成羧酸根后，以羧酸的鈉鹽形式存在，結(jié)合紅外光譜檢測的結(jié)果，說明6-羧基殼寡糖制備成功.

圖2 COS與C-COS的核磁共振(13C NMR)譜圖Fig.2 13C NMR spectra of COS and C-COS

2.1.3 酸堿電導(dǎo)滴定分析

利用酸堿電導(dǎo)滴定得到 COS與 C-COS相關(guān)數(shù)據(jù)繪制曲線，計算 C-COS中羧基含量，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：兩者第一階段均是溶液中的 HCl與 NaOH 反應(yīng)，隨著滴定的進行，H+與 OH－不斷結(jié)合生成不導(dǎo)電的 H2O，電導(dǎo)率下降；第二階段，殼寡糖(COS)的—NH2會與 HCl反應(yīng)生成氨基鹽酸鹽(RNH3Cl)，氨基鹽酸鹽與 NaOH反應(yīng)過程中溶液內(nèi)的 Na+等離子不斷增加，故電導(dǎo)率有短暫上升，而 6-羧基殼寡糖(C-COS)除了氨基鹽酸鹽，還有RCOONa在HCl溶液下生成的RCOOH、RCOOH與NaOH反應(yīng)，電導(dǎo)率緩慢上升；第三階段，當(dāng)溶液中的羧酸和氨基鹽酸鹽與 NaOH完全反應(yīng)后，隨著NaOH溶液消耗體積的增加，電導(dǎo)率會快速增大.

圖3 COS與C-COS的酸堿電導(dǎo)滴定分析圖Fig.3 Acid-base conductance titration analysis of COS and C-COS

將圖3電導(dǎo)滴定曲線中的 4個化學(xué)計量點對應(yīng)的體積(V1、V2、V3、V4)代入式(1)，計算后得到了 6-羧基殼寡糖的羧基含量為1.68%，這說明氧化只是將部分C6位羥基氧化為羧基.

2.2 C-COS體外清除ROS能力

2.2.1 對羥基自由基的清除活性

亞鐵離子與過氧化氫反應(yīng)可產(chǎn)生大量羥基自由基，添加不同質(zhì)量濃度的 COS和 C-COS，考察樣品對羥基自由基的清除作用，并與天然抗氧化劑VC進行比較，得到清除曲線，如圖4所示.由圖4可知：在0～6mg/mL范圍內(nèi)，COS、C-COS及VC的羥基自由基清除率均隨濃度增大顯著提高；當(dāng)質(zhì)量濃度升至4mg/mL時，此時COS、C-COS及VC對羥基自由基的清除率分別為 32%、93%、99%，之后曲線趨于平緩，清除率較為穩(wěn)定；且質(zhì)量濃度為 6mg/mL時，CCOS的羥基自由基清除率高達(dá)98%，其清除率與VC幾乎相同，此時的 COS的羥基自由基清除率僅為33%.可見，C-COS對羥基自由基的清除能力為COS的 2～3倍.這些結(jié)果表明，相比殼寡糖(COS)，6-羧基殼寡糖(C-COS)有更好的羥基自由基清除效果.

圖4 COS與C-COS對羥基自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of COS and C-COS on hydroxyl radicals

2.2.2 對過氧化氫的清除活性

用定量的過氧化氫，考察不同質(zhì)量濃度的 COS、C-COS、VC對過氧化氫的清除效果，清除曲線如圖5所示.

圖5 COS與C-COS對過氧化氫的清除作用Fig.5 Scavenging effect of COS and C-COS on hydrogen peroxide

由圖5可知：在樣品質(zhì)量濃度范圍為 1～5mg/mL時，COS與 C-COS清除過氧化氫能力隨濃度上升而增強；在 5mg/mL質(zhì)量濃度下，C-COS與COS對過氧化氫的清除率分別為 99%和 64%，CCOS較COS過氧化氫清除率顯著提高35%，且接近VC的清除率.結(jié)果表明，6-羧基殼寡糖較殼寡糖對過氧化氫的清除活性有所提高，且清除效果顯著.

2.2.3 對烷氧自由基的清除活性

氧化卵磷脂可產(chǎn)生烷氧自由基，考察不同質(zhì)量濃度的COS、C-COS與VC對烷氧自由基的清除效果，清除曲線如圖6所示.由圖6可知：COS與 C-COS對烷氧自由基具有清除作用，且在 1～5mg/mL范圍內(nèi)，隨著COS與 C-COS濃度的增加，清除烷氧自由基能力逐漸增強.在質(zhì)量濃度為 5mg/mL時，COS、C-COS、VC對烷氧自由基的清除率分別為 37%、59%、98%，C-COS較 COS清除率增加 22%，較 VC清除率減少 39%.這說明 6-羧基殼寡糖對烷氧自由基的清除效果強于殼寡糖，與VC相比還有差距.

圖6 COS與C-COS對烷氧自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of COS and C-COS on alkoxy radicals

2.2.4 對超氧陰離子自由基的清除活性

通過鄰苯三酚自氧化法制備出超氧陰離子自由基，配制不同質(zhì)量濃度的 COS進行超氧陰離子清除實驗，并與同質(zhì)量濃度下的 C-COS、VC進行對比，得清除曲線如圖7所示.

圖7 COS與C-COS對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of COS and C-COS on superoxide anion radical

由圖7可知：COS與C-COS對超氧陰離子自由基存在清除作用，在樣品濃度梯度為 0～5mg/mL時，COS與 C-COS清除超氧陰離子自由基能力均隨濃度上升有緩慢提高，但提高效率明顯不如清除羥基自由基；在 1mg/mL時，COS與 C-COS對超氧陰離子自由基的清除率分別是29%、35%，C-COS對超氧陰離子自由基的清除率僅比 COS多 6%，即 6-羧基殼寡糖較殼寡糖有小幅度的清除增強效果，效果不顯著的原因可能與清除不同自由基機制有關(guān).

2.3 螯合亞鐵離子的能力

亞鐵離子等金屬離子被認(rèn)為是影響活性氧自由基產(chǎn)生的重要因素之一，亞鐵離子越多，促進產(chǎn)生的自由基越多.通過對比COS與C-COS螯合亞鐵離子的能力大小，可進一步對其螯合作用官能團進行判斷.COS與 C-COS螯合亞鐵離子能力如圖8所示.由圖8可見：在 1～5mg/mL質(zhì)量濃度范圍間，隨樣品溶液濃度的升高，COS與C-COS對亞鐵離子的螯合能力逐漸增強.在質(zhì)量濃度為 5mg/mL時，COS與 C-COS對亞鐵離子的螯合能力分別為 25%和58%，C-COS較 COS螯合亞鐵離子能力增強 33%.由于C-COS與COS的唯一區(qū)別是C6位官能團的變化，推測出螯合能力的增強可能與 C-COS中 C6位羧基的出現(xiàn)有關(guān).

圖8 COS與C-COS螯合亞鐵離子的能力Fig.8 Ability of COS and C-COS chelating ferrous ions

3 清除自由基機理

自由基的生成為一系列連鎖反應(yīng)，包括引發(fā)、增值、終止3個階段，因此對應(yīng)有3種清除自由基的途徑.一是盡可能避免紫外線、輻射等自由基引發(fā)條件；二是減少 Fe2+等可以促進自由基生成的金屬離子；三是促使帶電子物質(zhì)與自由基結(jié)合生成穩(wěn)定大分子自由基[25-26].通過對比 6-羧基殼寡糖和殼寡糖清除活性氧(ROS)實驗，發(fā)現(xiàn) 6-羧基殼寡糖清除活性氧的能力相比殼寡糖均有不同程度的提高，即殼寡糖C6位羥基氧化為羧基后，清除活性氧能力增強.結(jié)合2.3節(jié)螯合亞鐵離子實驗結(jié)果，推測機理如圖9所示.圖9(a)、(b)為COS清除ROS機理，作用基團為C6位羥基、C3位羥基和 C2氨基，作用基團結(jié)合自由基(R·)，生成穩(wěn)定大分子物質(zhì)；同時溶液中氨基發(fā)生質(zhì)子化過程，所以氨基清除 ROS能力減弱，此過程羥基清除占主導(dǎo)地位.圖9(c)、(d)、(e)為 C-COS清除 ROS機理，作用基團為 C3位羥基、C2氨基和C6羧酸根.由于C-COS的C6位有羧酸根(—COO-)的存在，羧酸根質(zhì)子化抑制氨基(—NH2)形成，進而更多氨基的孤電子對提供電子給自由基(R·)，生成穩(wěn)定的自由基大分子；同時羧酸根本身具有螯合金屬離子能力[29]，多組 6-羧基殼寡糖的—COO-與 F e2+等金屬離子螯合，進而阻止金屬離子催化氧化生成ROS.所以，此過程氨基清除和羧酸根清除起主要作用，兩者共同作用大于 COS羥基的清除效果，所以整體評價C-COS清除ROS效果強于COS清除ROS效果.綜上所述，可看作6-羧基殼寡糖抑制氨基質(zhì)子化與螯合金屬離子兩者協(xié)同作用，即通過第二、第三途徑提高了清除ROS的能力.

圖9 COS和C-COS清除ROS機理圖Fig.9 ROS scavenging mechanism diagram of COS and C-COS

4 結(jié) 論

(1)利用漆酶/TEMPO 體系對殼寡糖(COS)分子結(jié)構(gòu)的C6位進行氧化修飾，成功制備出6-羧基殼寡糖(C-COS).

(2)通過體外實驗法發(fā)現(xiàn) 6-羧基殼寡糖(CCOS)較殼寡糖(COS)具有更高的清除 ROS能力，并且隨濃度的升高清除率逐漸提高，表明羧酸根的加入和濃度的大小可以影響清除活性氧的能力.其中不同氧自由基清除效果不一，清除能力大小為H2O2≥·OH＞RO·＞，清除自由基能力不同可能與自由基產(chǎn)生機制不同有關(guān).

(3)羥基自由基(·OH)作為最常見、最活躍、高流動性的自由基，6-羧基殼寡糖對其和過氧化氫的清除效果最佳，清除率可達(dá) 98%以上，最接近天然抗氧化劑 VC的清除效果，說明 6-羧基殼寡糖在抗氧化方面也有較大的應(yīng)用價值.

(4)根據(jù)羧酸根具有質(zhì)子化和螯合金屬離子的特點，結(jié)合自由基產(chǎn)生的機理，可進一步分析 6-羧基殼寡糖提高清除活性氧的原因，說明 C6位羧基和 C2氨基在清除自由基方面起積極作用，這也為殼寡糖類似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的改性及應(yīng)用提供了重要思路.