蔣先偉，馬戰(zhàn)平

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

慢性支氣管炎(Chronic bronchitis)為臨床常見的慢性呼吸道疾病，是累及氣管、支氣管黏膜及周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床中以反復(fù)發(fā)作的咳嗽、咯痰為主要癥狀，可伴或不伴喘息，且具有病程長、起病緩慢、反復(fù)發(fā)作的特點，該病影響患者生活質(zhì)量，嚴重威脅患者健康[1]。近年來，隨著中國老齡化社會加劇、環(huán)境污染及不健康生活方式等因素的影響，該病發(fā)病率逐年遞增，且發(fā)病人群出現(xiàn)年輕化趨勢[2]。目前，西藥治療在臨床中應(yīng)用較為廣泛，但其長期療效不佳，因此，慢性支氣管炎的臨床治療方案應(yīng)進一步優(yōu)化。

根據(jù)慢性支氣管炎臨床咳、痰等癥狀，可將其歸于中醫(yī)“咳嗽”“痰飲”范疇，其根本病機多與肺、脾、腎三臟虛損，痰飲留停肺內(nèi)有關(guān)。痰飲內(nèi)伏，每逢邪氣外襲則勾動內(nèi)邪，促使疾病加重?！鹅`樞·邪氣臟腑病形》云：“形寒寒飲則傷肺?！倍吒饰逦督翜珵閺堉倬八鶆?chuàng)，首載于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治第十二》，功擅溫肺化飲，在臨床中療效顯著。匡奕亮等[3]研究顯示，苓甘五味姜辛湯組對比常規(guī)西藥治療組，可有效提高治療效果，且治療安全性更高。研究[4]發(fā)現(xiàn)，苓甘五味姜辛湯可降低IL-2、IL-4，調(diào)節(jié)氣道炎癥因子表達，起到治療慢性支氣管炎的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將系統(tǒng)生物學(xué)及藥理學(xué)整合后，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索及計算機虛擬計算后，構(gòu)建出“藥物-成分-靶點-通路-疾病”間可視化網(wǎng)絡(luò)模型，進而通過分析，得出藥物與疾病相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵靶點，從而預(yù)測藥物治療疾病的機制[5]。該方法貼合中藥復(fù)方多靶點、多通路的治療特點，以及中醫(yī)藥對疾病的認知。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎可能關(guān)聯(lián)的靶點及通路，為挖掘苓甘五味姜辛湯的潛在價值提供思路及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苓甘五味姜辛湯有效成分的篩選及獲取

利用中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析系統(tǒng)平臺(TCMSP)搜索苓甘五味姜辛湯中茯苓、甘草、南五味子、干姜、細辛的全部化學(xué)成分。依據(jù)藥物ADME(Absorption，distribution，metabolism，excretion)特性，將口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%，以及類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選指標，獲取符合條件的活性成分。

1.2 苓甘五味姜辛湯潛在靶點和相關(guān)疾病靶點的獲取

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，收集茯苓、甘草、五味子、干姜、細辛所有有效成分靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名更換為官方名稱。利用DrugBank、GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫，將“chronic bronchitis”作為搜素關(guān)鍵詞進行搜索，將所獲取的疾病靶點進行整合、去重后即得慢性支氣管炎的疾病靶點。

1.3 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先利用PERL軟件將獲取到的藥物活性成分及潛在靶點與疾病靶點進行比對篩選，得出藥物活性成分可作用于疾病靶點的相關(guān)成分與靶點，然后將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)圖中node1代表藥物，node2代表靶點，edge代表不同節(jié)點間的相互關(guān)系。

1.4 苓甘五味姜辛湯與疾病交互靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用R軟件進行藥物與疾病交互靶點的并集獲取，并繪制出Venn圖。利用STRING網(wǎng)絡(luò)平臺構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)互作模型，最低相互作用閾值設(shè)為(>0.9)，并去除游離在外的靶點，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)互作模型圖。將獲得的網(wǎng)絡(luò)用Cytoscape 3.8.0 軟件中CytoNCA插件進行核心靶點篩選，獲得相關(guān)核心基因。

1.5 GO生物學(xué)過程與KEGG信號通路富集分析

采用 R 4.0.2 的 Bioconductor 數(shù)據(jù)包進行靶點GO生物學(xué)功能及KEGG通路富集分析，設(shè)置P值為 0.05，q值為0.05進行分析，輸出結(jié)果并繪制相應(yīng) barplot柱狀圖及氣泡圖，根據(jù)最后結(jié)果，得出關(guān)鍵的生物學(xué)過程及相關(guān)通路，從而探討苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎的相關(guān)機制。

2 結(jié)果

2.1 苓甘五味姜辛湯活性成分篩選

通過TCMSP平臺檢索，苓甘五味姜辛湯中茯苓得到化學(xué)成分34種，甘草280種，南五味子39種，干姜148種，細辛192種。根據(jù)口服利用度(OB)及類藥性(DL)篩選得出苓甘五味姜辛湯共有133種主要活性成分，其中茯苓15種，甘草92種，南五味子13種，干姜5種，細辛8種。

2.2 苓甘五味姜辛湯潛在靶點獲取

將獲取到的主要活性成分在TCMSP平臺中再次搜索，并與潛在靶點逐一匹配，去除無靶點活性成分，得到苓甘五味姜辛湯潛在靶點。其中，茯苓31個靶點，甘草1 769個，南五味子7個，干姜54個，細辛164個，共獲得潛在靶點2 026個。然后將獲得的靶點利用Uniprot數(shù)據(jù)庫平臺將靶點名更正為官方基因名，并剔除重復(fù)，最終共獲得1 708個潛在靶點。

2.3 慢性支氣管炎已知靶點獲取

以“chronic bronchitis”作為搜索關(guān)鍵詞，在DrugBank、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲得已知與疾病相關(guān)的靶點，其中，DrugBank獲取到58個，GeneCards獲取到1 853個，OMIM獲取到43個，整合3個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點信息并剔除重復(fù)后，最終獲得疾病相關(guān)基因1 893個。

2.4 疾病-藥物靶點整合與獲取共同靶點

應(yīng)用R語言軟件，將獲得的藥物潛在靶點及疾病相關(guān)靶點進行整合，獲取到交集基因，然后通過R軟件繪制韋恩圖(venn)，并記錄苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎的交集基因，最終獲得共同靶點125個。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集基因韋恩圖

2.5 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.4”中獲得的交集基因?qū)隒ytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點的中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)，其中，外周節(jié)點代表藥物成分(三角形代表茯苓，倒三角代表甘草，菱形代表南五味子，八邊形代表干姜，橢圓形代表細辛，平行四邊形代表藥物共有成分)，矩形方陣代表作用靶點。按照Degree進行排序，其節(jié)點越大，代表其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。其中，節(jié)點度值居前10位的靶點為PTGS2、ESR1、AR、HSP90AB1、NOS2、PPARG、CDK2、ESR2、CCNA2、SCN5A。節(jié)點度值較高的化學(xué)成分為槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A等。

圖2 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將獲得的125個交集基因上傳至STRING網(wǎng)絡(luò)平臺，進行搜索，更改最低相互作用閾值為>0.9，并除去游離節(jié)點，得到圖3，其中每個節(jié)點代表每種蛋白，每條邊代表蛋白之間的相互作用，共有125個節(jié)點，522條邊。將所獲得的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，利用CytoNCA插件進一步計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的DC、BC、CC、EC、LAC及NC值，得到網(wǎng)絡(luò)中DC中位數(shù)為6.5，BC中位數(shù)為42.64，CC中位數(shù)為0.150 9，EC中位數(shù)為0.046，LAC中位數(shù)為2.944，NC中位數(shù)為3.675。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方法，得到關(guān)鍵基因39個，再次進行分析后獲得核心基因15個，分別是ESR1、AKT1、CCND1、MAPK14、JUN、STAT3、MAPK1、NR3C1、TP53、CDKN1A、MAPK8、RELA、MAPK3、MYC、RB1。這些靶點在網(wǎng)絡(luò)中作為核心靶點，在苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎中起重要作用。見圖4。

圖3 交集基因互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI核心網(wǎng)絡(luò)篩選

2.7 GO富集分析與KEGG分析

應(yīng)用R語言將交集基因進行GO富集分析與KEGG通路富集分析，并繪制相應(yīng)氣泡圖。GO分析共獲得GO條目2 441條，其中生物過程(BP)主要條目為活性氧代謝過程(Reactive oxygen species metabolic process)、抗生素反應(yīng)(Response to antibiotic)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(Cellular response to oxidative stress)、對細菌源分子的反應(yīng)(Response to molecule of bacterial origin)、對脂多糖的反應(yīng)(Response to lipopolysaccharide)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(Cellular response to chemical stress)等。細胞組分(CC)主要條目為細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物(Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex)、蛋白激酶復(fù)合物(Protein kinase complex)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(Transcription regulator complex)等。分子功能(MF)主要條目為組蛋白激酶活性(Histone kinase activity)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、蛋白磷酸酶結(jié)合(Protein phosphatase binding)等(見圖5)。KEGG信號通路富集分析共獲得165條，選取其中富集程度最高的30條通路，形成氣泡圖，其中，氣泡越大代表富集條目越多(見圖6)。主要信號通路為PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等。

圖5 GO分析氣泡圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

慢性支氣管炎作為臨床常見病、多發(fā)病，其反復(fù)發(fā)作及遷延難愈的特點長期困擾醫(yī)患。而中醫(yī)藥治療慢性支氣管炎效果良好，在緩解臨床癥狀及疾病長期管理上優(yōu)勢獨到。苓甘五味姜辛湯作為治療“咳嗽”“痰飲”的經(jīng)典名方，應(yīng)用廣泛，臨床療效較好。因此，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，挖掘苓甘五味姜辛湯治療機制，為臨床提供科學(xué)依據(jù)，具有重要意義。

3.1 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過對中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn)，其中主要化學(xué)成分為槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A等。主要作用靶點為PTGS2、ESR1、AR、HSP90AB1、NOS2、PPARG、CDK2、ESR2、CCNA2、SCN5A等。槲皮素及山奈酚是甘草的活性成分，具有良好的抗炎作用，如李林蔓等[6]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡、HO-1表達而起到較好的抗炎作用，亦有報道[7]稱槲皮素可降低肺泡灌洗液及肺組織中IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子水平，從而抑制香煙煙霧引起的氣道重塑。研究[8]表明，山柰酚具有明顯的抗炎作用，其作用機制主要包括調(diào)節(jié)促炎酶的活性及炎癥相關(guān)基因表達等。趙妍等[9]證實，山柰酚可減輕脂多糖導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷，其機制可能是通過抑制多種促炎因子，如NF-κB、IL-1β、HO-1、PTGEs等 mRNA的表達，以及促進抗炎因子HO-1 mRNA的表達而發(fā)揮保護作用。β谷甾醇是一種植物甾醇，現(xiàn)代研究較少，但也有報道其具有抗菌、抗炎、抗真菌的作用[10]。嚴寧等[11]證實，β谷甾醇可通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6及TNF-α水平，改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)。茯苓酸A是茯苓的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎的功效，秦劭晨等[12]研究發(fā)現(xiàn)，茯苓酸具有抑制TNF-α誘導(dǎo)SH-SY5Y的炎癥及氧化應(yīng)激損傷作用。而在主要作用靶點中，PTGS2與慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)是通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)前列腺素E2(PGE-2)從而起到調(diào)節(jié)炎癥的作用[13]。因此，可以推測苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎主要是發(fā)揮其抗炎、抗氧化及減輕損傷等方面作用。

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點

PPI核心網(wǎng)絡(luò)篩選主要結(jié)果為雌激素受體1(ESR1)、絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK14、MAPK1、MAPK8、MAPK3)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、細胞周期蛋白D1(CCND1)、轉(zhuǎn)錄因子(JUN)等。STAT是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，該信號參與了先天免疫、適應(yīng)性免疫，急、慢性炎癥反應(yīng)及腫瘤等疾病的發(fā)生[14]。STAT3作為傳導(dǎo)因子，可被各種刺激激活，從而在各種炎癥反應(yīng)中起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，研究[15]表明，IL-6結(jié)合受體后可活化JAK1，并促使STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活，最終調(diào)控T細胞的分化及炎癥反應(yīng)。王月月等[16]證實，哮喘患者體內(nèi)巨噬細胞向M2極化，協(xié)同共刺激分子B7-H3促進CD4+T細胞向Th2方向極化與巨噬細胞中STAT3表達增加相關(guān)。MAPK信號通路作為已知炎癥相關(guān)性信號通路，其由p38、ERK及JNK信號通路組成，是參與炎癥反應(yīng)的主要組成部分[17]。劉茈蕊等[18]發(fā)現(xiàn)，大承氣湯可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK與ERK1/2這2條MAPK途徑磷酸化進程來抑制哮喘小鼠炎癥表達。周吉等[19]研究表明，使用P38 MAPK抑制劑可顯著減輕大鼠機械通氣相關(guān)肺損傷中炎癥因子、炎癥細胞的趨化。因此，STAT3及MAPK信號通路在慢性支氣管炎的發(fā)病過程中起著舉足輕重的作用。

3.3 苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎主要涉及的生物通路

通過KEGG通路富集分析后，得到的主要通路有PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路、人巨細胞病毒感染、小細胞肺癌等。在慢性支氣管炎現(xiàn)代機制研究中，炎癥反應(yīng)成為其核心機制，且存在黏液高分泌、氧化應(yīng)激、氣道重塑等多種方式。結(jié)合慢性支氣管炎發(fā)病機制及富集通路，筆者推測苓甘五味姜辛湯主要通過緩解炎癥反應(yīng)發(fā)揮其治療作用。在慢性支氣管的炎癥反應(yīng)中，由多種炎癥因子廣泛參與，除較為常見的白介素-6、腫瘤壞死因子(TNF)外，由Th17細胞特異性分泌的白介素-17，可刺激支氣管上皮細胞釋放 IL-8 募集中性粒細胞，參與炎癥反應(yīng)[20]。TNF可誘導(dǎo)細胞內(nèi)多種信號通路，包括細胞凋亡、炎癥、免疫等，其激活后結(jié)合的受體TNFR2可激活NF-κB通路，包括PI3K依賴性NF-κB通路及JNK通路，與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[21]。研究表明，PI3K/AKT/m TOR通路對Th17細胞具有積極的調(diào)控作用，KUREBAYASHI等[22]研究發(fā)現(xiàn)，通過PI3K/m TORC1抑制劑及敲除raptor，抑制AKT活性，進而影響了體外及體內(nèi)Th17細胞分化，使IL-17A、IL-17F產(chǎn)生減少。而有研究[23]亦證實了PI3K信號通路與肺組織中嗜酸粒細胞増多、氣道黏液分泌增多、氣道高反應(yīng)性的相關(guān)性。以上均提示，苓甘五味姜辛湯可能通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路(見圖7)、IL-17 信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、影響?zhàn)ひ悍置诘茸饔?，從而達到治療慢性支氣管炎的效果。此外，GO富集分析得出苓甘五味姜辛湯主要通過活性氧代謝過程、抗生素反應(yīng)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物過程發(fā)揮治療作用。

圖7 PI3K-Akt 信號通路

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討了苓甘五味姜辛湯治療慢性支氣管炎的作用機制，發(fā)現(xiàn)具有治療效果的主要成分為槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A；主要作用靶點為ESR1、AKT1、CCND1、MAPK14、JUN、STAT3、MAPK1、NR3C1、MAPK3等。而根據(jù)GO富集分析及KEGG通路富集分析得出其主要通過活性氧代謝過程、抗生素反應(yīng)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)，以及通過PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路等治療慢性支氣管炎。這些數(shù)據(jù)為臨床應(yīng)用及相關(guān)研究提供了一定依據(jù)，但本研究仍存在不足，還需動物實驗加以驗證。