劉德果，李姿蓉，趙 姣，陳其華*，蘇藝峰

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

前列腺癌是男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，但現(xiàn)階段并無確切有效的治療手段[1]。諸多研究表明，中醫(yī)藥在改善前列腺癌患者具體癥狀、調(diào)控其精神心理狀態(tài)等方面具有明顯的療效[2]。

中醫(yī)古籍并無本病的記載，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)及病機(jī)可歸于“癥瘕”“癃閉”“尿血”等疾病[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，前列腺癌病在男性之精竅，與腎、脾、肝等臟密切相關(guān)，脾腎虛衰，陰陽失調(diào)為發(fā)病之因，情志飲食傷及臟腑為起病之源，瘀毒久積、邪郁下焦為致病之標(biāo)，在治療上多以扶正祛邪為治療原則，而“淫羊藿-三七”配伍是臨床上較常使用的溫陽活血抗癌藥對(duì)?，F(xiàn)階段對(duì)淫羊藿、三七單味藥的藥效或藥理學(xué)相關(guān)研究較多，但對(duì)于“淫羊藿-三七”配伍應(yīng)用于治療前列腺癌的藥效機(jī)制的報(bào)道較少，具體作用機(jī)制尚未明確。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，進(jìn)行“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)可視化分析，在系統(tǒng)層面及分子水平對(duì)“淫羊藿-三七”配伍的藥物活性成分、潛在治療關(guān)鍵靶點(diǎn)以及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，以期對(duì)“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行探討，同時(shí)為接下來的基礎(chǔ)研究驗(yàn)證“淫羊藿-三七”配伍作用機(jī)制提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選淫羊藿及三七的藥物有效活性成分與藥物靶點(diǎn)

本研究借助TCMSP及TCMID等數(shù)據(jù)庫檢索淫羊藿及三七的藥物有效活性成分與藥物靶點(diǎn)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：OB>30%，DL>0.18，HL>4 h。之后選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫的“Related Targets”模塊，得到淫羊藿和三七的所有藥物靶點(diǎn)基因。

1.2 獲取前列腺癌疾病靶點(diǎn)基因

以“Prostate cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org)以及OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)中進(jìn)行檢索。在完成關(guān)鍵詞檢索后將上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的前列腺癌相關(guān)基因進(jìn)行合并剔除重復(fù)項(xiàng)后建立“前列腺癌疾病靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫”備用。將淫羊藿、三七的藥物靶點(diǎn)基因與前列腺癌疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，獲得“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的靶點(diǎn)基因。

1.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)可視化分析

將淫羊藿、三七治療前列腺癌的靶點(diǎn)基因和步驟1.2篩選獲得的淫羊藿、三七活性成分進(jìn)行映射，對(duì)藥物活性成分和靶點(diǎn)基因的關(guān)聯(lián)進(jìn)行構(gòu)建，獲得“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的藥物活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。Cytoscape軟件多用于構(gòu)建生物分子相互作用的網(wǎng)絡(luò)可視化分析。結(jié)合前述步驟獲得的數(shù)據(jù)建立“Ingredient_Drug”“Ingredient_Target”“Disease_Target”“Drug_Disease”文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.1中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

借助STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)及CentiScape插件對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的關(guān)系進(jìn)行分析，以期構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，展示其中的關(guān)鍵靶基因。

1.5 關(guān)鍵靶基因本體富集(GO)及京都基因與基因組百科全書通路富集(KEGG)分析

借助R軟件(Version3.5.2)安裝Bioconductor軟件包“colorspace”、“stringi”、“clusterProfiler”并運(yùn)行，將淫羊藿與三七治療前列腺癌的關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)換為entrez ID。之后將已完成轉(zhuǎn)換的entrez ID，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集分析，同時(shí)將分析結(jié)果以條形圖及氣泡圖形式導(dǎo)出。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿及三七的藥物有效活性成分與藥物靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“淫羊藿”“三七”分別獲得130個(gè)和119個(gè)活性成分。以O(shè)B>30%，DL>0.18，HL>4 h為條件進(jìn)行篩選，分別篩選出18個(gè)淫羊藿及7個(gè)三七活性成分，去重后共獲得24個(gè)“淫羊藿-三七”配伍的有效活性成分。選取“Related Targets”模塊，獲得1 620個(gè)淫羊藿、716個(gè)三七所有活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因?！耙蜣健薄叭摺迸湮榈闹饕行Щ钚猿煞忠姳?。

表1 “淫羊藿-三七”配伍的主要有效活性成分

2.2 前列腺癌疾病靶點(diǎn)基因獲取

在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“Prostate cancer”，共篩選出11 667個(gè)前列腺癌疾病靶點(diǎn)基因。將淫羊藿、三七的藥物靶點(diǎn)基因與前列腺癌疾病靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，共獲得64個(gè)“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的靶點(diǎn)基因，見圖1。

注：“淫羊藿-三七”配伍活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與前列腺癌相關(guān)基因有64個(gè)共同靶基因。

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“淫羊藿-三七”與對(duì)應(yīng)活性成分(Ingredient_Drug)、活性成分與關(guān)鍵靶基因(Ingredient_Target)、關(guān)鍵靶基因與前列腺癌對(duì)應(yīng)關(guān)系(Disease_Target)、“淫羊藿-三七”與疾病靶點(diǎn)基因(Drug_Disease)以及屬性導(dǎo)入到Cytoscape，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。使用CentiScape插件計(jì)算藥物活性成分DC，節(jié)點(diǎn)的DC越大，提示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中權(quán)重越大。Quercetin(槲皮素)為69，luteolin(木犀草素)為32，keampferol(山奈酚)為19，Anhydroicaritin(脫水淫羊藿素)為14、8-Isopentenyl-kaempferol為12，位于前五位。由圖2可知，網(wǎng)絡(luò)圖中有多個(gè)節(jié)點(diǎn)及邊，提示藥物靶點(diǎn)基因與疾病靶點(diǎn)基因之間存在較多的交集作用，充分體現(xiàn)“淫羊藿-三七”配伍是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的方式發(fā)揮治療前列腺癌的作用。其活性成分DC較高的藥物如槲皮素、木犀草素、山奈酚、脫水淫羊藿素等具有較顯著的抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)免疫功能作用，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[17-18]。

注：菱形為前列腺癌，六邊形為“淫羊藿-三七”配伍，長方形為“淫羊藿-三七”配伍活性成分，橢圓形為關(guān)鍵靶基因，連線代表各節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

把獲得的關(guān)鍵靶基因?qū)胗赟TRING的Multiple proteins模塊，置信度為0.4，將PPI.tsv文件導(dǎo)入到Cytoscape軟件，獲得64個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)基因。以CentiScape插件計(jì)算出DC均值為13.7，選取DC大于均值的基因作為核心基因以大于17.8進(jìn)行篩選，獲得26個(gè)核心基因，具體見圖3。

圖3 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析

通過GO功能富集分析筆者共富集到82個(gè)生物學(xué)過程及功能，經(jīng)校正排序后對(duì)位于前20的生物過程進(jìn)行條形圖展示，具體見圖4?！耙蜣?三七”配伍主要參與的生物過程包括泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、核受體功能、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞凋亡、雌激素受體結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇激素受體結(jié)合、核激素受體結(jié)合、單加氧酶活性、氧化還原過程、激素受體結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合、組蛋白激酶活性等。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析筆者共富集到56條細(xì)胞信號(hào)通路，經(jīng)校正排序后對(duì)位于前20的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行氣泡圖展示，具體見圖5。“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的主要細(xì)胞信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細(xì)胞凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、內(nèi)分泌抵抗、腫瘤壞死因子(TNF)、細(xì)胞衰老、p53等細(xì)胞信號(hào)通路。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因KEGG通路富集分析

3 討論

現(xiàn)階段，隨著對(duì)前列腺癌發(fā)病及治療相關(guān)機(jī)制的研究不斷取得進(jìn)展，其龐雜的病理機(jī)制逐漸被揭示，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，前列腺癌的形成機(jī)制包括腫瘤雄激素受體機(jī)制、干細(xì)胞形成機(jī)制以及炎性刺激相關(guān)機(jī)制等[4]。諸多臨床研究結(jié)果顯示，“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌可獲得良好的臨床效果。然而，在中藥中存在多成分、多靶點(diǎn)的特征，各藥物活性成分間相互交集及作用形成了龐雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，所以給研究者探究其治療有效成分及相關(guān)機(jī)制造成了較大的困難。

在本研究中，淫羊藿及三七的藥物主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、脫水淫羊藿素、8-Isopentenyl-kaempferol等。Mzhelskaya等[5]的研究結(jié)果顯示，槲皮素能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期、腫瘤血管生成因子(VEGF)以及制止耐藥基因表達(dá)降低前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡，其常見的細(xì)胞信號(hào)通路多為磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細(xì)胞凋亡等。木犀草素具有顯著的抑制前列腺癌細(xì)胞增殖功能，李楠等[6]的研究表明，木犀草素能夠顯著抑制與細(xì)胞增殖緊密關(guān)聯(lián)的JAK2/STAT3細(xì)胞信號(hào)通路以及Ki67的蛋白表達(dá)，并在一定程度上呈劑量依賴性。El-Kott等[7]發(fā)現(xiàn)，山奈酚能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S期，并且可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡；Sinha等[8]研究表明，山奈酚可抑制雌激素受體alpha(ESR1)使LNcap細(xì)胞的侵襲性下降，同時(shí)能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。脫水淫羊藿素具有較強(qiáng)大的雌激素活性及抗氧化活性，同時(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡功能[9]。8-Isopentenyl-kaempferol目前相關(guān)研究較少，有研究顯示其與細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制相關(guān)[26]。故“淫羊藿-三七”配伍里的活性成分與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)，對(duì)于前列腺癌的治療有著重要作用。

對(duì)構(gòu)建的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)以及PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，顯示ESR1、AR、CCND1、VEGFA、CASP3、MYC、HIF-1A等核心靶點(diǎn)與眾多藥物有效成分存在交互作用，并在構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)出聚集現(xiàn)象，提示上述核心靶點(diǎn)可作為“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的潛在靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。其中雌激素受體(ESR1)是一類固醇類激素蛋白，能夠與雌激素特異性結(jié)合使其發(fā)揮激素生物學(xué)效應(yīng)，干預(yù)相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控前列腺上皮細(xì)胞以及前列腺癌細(xì)胞的生長、增殖以及凋亡等生物學(xué)過程。關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO功能富集分析結(jié)果顯示，“淫羊藿-三七”配伍參與的生物過程主要集中于泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合，核受體功能、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)功能，以及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等方面[10-13]。上述生物學(xué)過程以及功能體現(xiàn)在于“淫羊藿-三七”的有效活性成分調(diào)控相應(yīng)的靶點(diǎn)基因以及細(xì)胞信號(hào)通路的過程中。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，上述“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的潛在靶點(diǎn)與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細(xì)胞凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、內(nèi)分泌抵抗、腫瘤壞死因子(TNF)、細(xì)胞衰老、p53等細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控息息相關(guān)，提示上述生物學(xué)過程及功能和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上述生物學(xué)過程及相關(guān)機(jī)制表明，前列腺癌的疾病靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、分化、遷移以及血管生成等方面。基于此，本研究揭示了“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用機(jī)制可能與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細(xì)胞凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、內(nèi)分泌抵抗、腫瘤壞死因子(TNF)、細(xì)胞衰老、p53等相關(guān)，為“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的進(jìn)一步研究提供一定的借鑒及參考。

本研究分析了藥對(duì)“淫羊藿-三七”配伍作用的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)以及相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示其能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降低內(nèi)分泌抵抗、殺傷腫瘤細(xì)胞以及抑制腫瘤血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。初步揭示了“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的潛在調(diào)控機(jī)制，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，為“淫羊藿-三七”配伍藥理研究及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。