李俊君，董 良，譚 琨，余 顏，俞旭君，陽 方

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川 成都 610041)

男性不育癥為男科常見的疾病之一，近年來發(fā)病率不斷上升，已成為一個全球化的社會性問題[1]。男性不育癥可能是多種因素造成的結(jié)果，在影響人類精子發(fā)生的因素中，精液常規(guī)檢查異常引發(fā)的不育已被大眾熟知，但仍有檢查正常的男性也存在不育。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷作為一種新的精子功能評價指標(biāo)越來越受到關(guān)注[2]。

精子DNA損傷可影響精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎發(fā)育，是影響生育的重要因素。DNA碎片率(DNA fragmentation index，DFI)是目前較常用于評估精子DNA完整性損傷程度的指標(biāo)，當(dāng)精子DNA損傷比例大于30%以上時，男性的自然生育力顯著降低[3]。氧化應(yīng)激是精子DNA損傷發(fā)生的一個機(jī)制。氧化應(yīng)激指機(jī)體遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如ROS和活性氮自由基(RNS)產(chǎn)生過多，氧化程度超出抗氧化物的清除范圍，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。過氧化物歧化酶(SOD)是能特異性地清除ROS的一種酶，因此，SOD測定能體現(xiàn)精子在男性生殖道運行中氧化抗氧化的水平和能力。

中醫(yī)學(xué)關(guān)于男性不育癥的論述主要集中在“無嗣”“無子”等方面。對于久病之人，腎氣嚴(yán)重虧損，無處藏精，故久病必虛，虛則血瘀，當(dāng)用補腎活血之法。成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研發(fā)的 “強精片”具有補腎強精、活血化瘀、清熱利濕的功效，臨床應(yīng)用已達(dá)15年余。研究發(fā)現(xiàn)[4]，該藥可顯著改善男性不育癥患者精子動態(tài)及形態(tài)，有增加精子密度、增加精子活率及活力、改善精子形態(tài)等作用。

本文將從“強精片”入手，研究補腎活血法抗氧化作用對腎虛血瘀型男性不育癥患者精子DNA損傷的影響并探索其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《人類精子學(xué)》(2013版)、《歐洲泌尿外科學(xué)會疾病診斷治療指南》(2014版)、《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(WHO第五版，2009年)以及相關(guān)試劑盒說明書等制定。(1)夫婦同居一年以上，性生活正常，未采取避孕措施，女方生殖機(jī)能正常，因男方因素造成女方不孕者。(2)實驗室檢查：①精子DNA碎片率(DFI)異常(正常精子DNA損傷率為0%～15%；輕度損傷：精子DNA損傷率為15%～30%；重度損傷：精子DNA損傷率為>30%)。 ②精子活性氧自由基(ROS)異常(正常測試范圍：0 RLU/s-5.5RLU/s×104)。③超氧化物歧化酶(SOD)異常(正常測試范圍：0.5～15 0ng/mL)。

1.1.2 中醫(yī)辨證診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002版)、《中國中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)》(張敏健、郭軍主編，2011版)制定。主證：久婚未育，腎虛血瘀：腰膝酸軟，神疲乏力，小腹隱痛(痛有定處)；次證：性欲低下，頭暈耳鳴，小便清長，皮下包塊(瘀斑)，舌質(zhì)紫暗有瘀斑，脈澀或沉細(xì)。凡具備主證1項或2項、次證2項，結(jié)合舌脈改變，經(jīng)兩名及以上副高專業(yè)技術(shù)職稱人員參與診斷，方可成立。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且符合中醫(yī)辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)；②不育年限達(dá)1年以上，年齡20～55歲的男性不育癥患者；③DFI>15%；④無嚴(yán)重器質(zhì)性疾病和精神、神經(jīng)系統(tǒng)疾??；⑤患者自愿受試并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①因女方因素導(dǎo)致的不能生育者；②泌尿生殖感染、激素異常、染色體核型異常及免疫性引起的男性不育；③合并有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病及精神病患者；④不能按規(guī)定服藥，無法判斷療效或資料不全等影響療效和安全性判斷者；⑤取精困難不能滿足實驗室檢查者。

1.4 一般資料

研究對象為2015年1月-2015年12月就診于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的72例男性不育癥患者，中醫(yī)辨證為腎虛血瘀型，以1∶1隨機(jī)分為兩組。研究對象中年齡最小者22歲，最大者43歲，平均年齡(31.71±4.55)歲。

1.5 治療方法

對照組：五子衍宗丸治療(提供單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，每盒10袋，每袋6g)，每次1袋，飯后溫水吞服，1日2次。連續(xù)治療3個月。

治療組：強精片治療，組方：人參、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、鹿角膠、車前子、益母草、桃仁、丹參(提供單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑中心，規(guī)格100片/瓶，每片0.3 g，每片含生藥0.35 g)，每次4片，飯后溫水吞服，每日3次，連續(xù)治療3個月。

1.6 觀察指標(biāo)

通過檢測受試者服藥前后精子DNA碎片率(DFI)、精子活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)的變化來評價療效。DFI檢測采用深圳市博瑞德生物科技有限公司生產(chǎn)的精子DNA碎片檢測試劑盒(商品名：SpermFuncRDNAf，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：YZB/粵0439-2010)進(jìn)行檢測。主要方法是利用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法。ROS檢測使用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒(產(chǎn)品序號：E004，規(guī)格：100T-500T，產(chǎn)品許可證：蘇ICP備12006455號)，用化學(xué)發(fā)光法檢測精液ROS水平。SOD變化采用ELISA生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(商品名：Human SOD ELISA kit，貨號：XL-Eh1377，規(guī)格：96孔/盒，Abcam公司生產(chǎn)，北京永輝生物科技有限公司進(jìn)口)進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

本研究納入72例患者，每組各36例，試驗過程中治療組患者因工作原因脫落2例，對照組脫落3例，1例因療效不滿意終止，2例因準(zhǔn)備試管嬰兒治療而終止。

2.1 治療組與對照組平均年齡及不育年限分析結(jié)果

通過對兩組男性年齡進(jìn)行分析，t=1.16，P=0.288 3，P>0.05，因此兩組年齡無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組具有可比性。對兩組男性不育年限的數(shù)據(jù)分析，平均不育年限為(4.50±1.58)年，經(jīng)分析得出兩組不育年限均呈非正態(tài)性分布，故采用Z檢驗，Z=1.27，P=0.2679，P>0.05，提示兩組平均不育年限無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組具有可比性。

表1 兩組患者平均年齡、不育年限比較

2.2 治療前受試者年齡與DFI、ROS、SOD相關(guān)性分析

對72例受試者年齡與DFI、ROS、SOD進(jìn)行相關(guān)性線性分析，圖1所示年齡與DFI，其線性擬合比率F=4.50，P<0.000 1，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明受試者年齡與DFI呈正相關(guān)；圖2所示DFI與ROS，其線性擬合比率F=0.47，P<0.000 1，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明受試者ROS與DFI有相關(guān)性，二者呈正相關(guān)；圖3所示ROS與SOD，其線性擬合比率F=-7.86，P<0.000 1，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明ROS與SOD有相關(guān)性，二者呈負(fù)相關(guān)。

圖1 年齡與DFI相關(guān)性分析

圖2 DFI與ROS相關(guān)性分析

圖3 ROS與SOD相關(guān)性分析

2.3 試驗后治療組與對照組DFI、ROS、SOD比較分析

治療組治療前DFI平均值為(25.24±9.76)，經(jīng)過3個月治療后，治療組DFI平均值為(10.95±4.55)，Z=9.272 8，P=0.004 5，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組治療前DFI平均值為(23.37±9.91)，經(jīng)過治療后，對照組DFI平均值為(15.38±6.33)，Z=8.36，P<0.000 1，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由表2可知，試驗組與對照組比較DFI顯著下降。

表2 試驗組、對照組治療前后DFI值比較

表3 兩組患者治療前后ROS(RLU/s)比較

治療組治療前ROS平均值=(41.41±19.28)%，經(jīng)過3個月的治療后，治療組ROS平均值為(13.74±8.88)%，Z=4.20，P=0.000 2，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組治療前ROS平均值=(42.91±19.74)%，經(jīng)過治療后，對照組DFI平均值為(20.37±12.65)%，Z=3.21，P=0.018 1，P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。治療組、對照組ROS平均值較治療前有顯著下降，且治療組下降明顯。

表4 治療組、對照組治療前后SOD比較

治療組治療前SOD平均值為(14.19±7.15) ng/mL，經(jīng)過3個月的治療后，治療組SOD平均值為(28.01±11.18) ng/mL，Z=7.19，P=0.011 2，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組治療前SOD平均值為(15.99±6.40) ng/mL，治療后，對照組SOD平均值為(20.20±6.25) ng/mL，Z=6.98，P<0.000 1，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明治療組SOD平均值較治療前有顯著提高，且優(yōu)于對照組。

2.4 中醫(yī)證候評分療效比較

兩組患者經(jīng)過3個月治療后，治療組總有效率為77.78%；對照組總有效率為66.67%，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明治療組運用補腎活血法(強精片)能有效改善中醫(yī)臨床癥狀，且優(yōu)于對照組。

表5 兩組患者中醫(yī)證候評分療效比較 (n)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，精子的生成依賴于腎氣的溫煦與滋養(yǎng)。腎為先天之本，是發(fā)育生殖之源?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》提出了以“腎”為軸心的生殖理論?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩疲骸罢煞颉?，腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子”。腎氣的盛衰，天癸的有無，臟腑功能是否協(xié)調(diào)，直接決定著男性的生殖能力的強弱。故精子質(zhì)量異常所致男性不育癥與中醫(yī)學(xué)的腎虛關(guān)系密切。瘀血作為病理產(chǎn)物，可因濕、熱、郁煎熬日久，或壅滯血脈，滯血成瘀，或肝失疏泄，氣滯阻絡(luò)而成。《臨證指南醫(yī)案》云“凡經(jīng)主氣，絡(luò)主血，久病血瘀”，“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”。皆因病久氣血陰陽虧虛，無力鼓動血運，血滯于經(jīng)；或久病而致氣機(jī)逆亂，氣滯則瘀血易生。男性產(chǎn)精的主要器官睪丸屬“陰器”，屬體表絡(luò)脈系統(tǒng)，容易因久病而氣血瘀滯?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》云“血氣不和，百病乃生”，瘀血內(nèi)停，脈絡(luò)瘀滯，氣血不運，睪丸失養(yǎng)受損，腎虛精虧，發(fā)為不育。在臨床中，腎虛與血瘀往往并見，但亦有腎虛為因、血瘀為果者。腎虛可分為精虧、腎氣虛、腎陽虛、腎陰虛，然而無論何種腎虛，都有致瘀的可能?！秲?nèi)經(jīng)》有“肝腎同源”之說，精之不足，無以化血，瘀血而成。故腎虛與血瘀的關(guān)系尤為密切，不能分而立論。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中醫(yī)理論的腎大致可以理解為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的下丘腦-垂體-性腺、腎上腺組成的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)軸。精子的發(fā)生、成熟、運行以及維持正常和穩(wěn)定，是通過此軸系的相互匹配、調(diào)節(jié)整合作用來實現(xiàn)的[5]。更有學(xué)者對中醫(yī)的腎之本質(zhì)進(jìn)行研究，認(rèn)為下丘腦-垂體-性腺軸功能失調(diào)是男性不育癥的常見病因[6-7]。血在男性生殖生理中起重要作用。首先血有濡養(yǎng)、滋潤生殖器官的作用；其次血能運輸天癸以達(dá)全身，腎氣足則天癸至，發(fā)揮正常的生理效應(yīng)：第三，血在體內(nèi)運行不息，流至精室時，在天癸作用下，可變化為精液。故唐容川在《血證論》中云：“血人丹田，亦從水化，而變?yōu)樗?，以其體內(nèi)為血所化，故非清水，而極濃極稠，謂之腎精?！爆F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為正常的血液運行是生殖系統(tǒng)有生育能力的基本條件。

本研究使用的“強精片”由人參、當(dāng)歸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、鹿角膠、車前子、益母草、桃仁、丹參等藥物組成。方中枸杞、菟絲子補腎益精，共為君藥。鹿角膠、淫羊藿溫補肝腎，益精養(yǎng)血，二者鼓舞腎中陽氣，使陰得陽助，而泉源不竭；人參補氣生津，丹參、桃仁、當(dāng)歸養(yǎng)血活血，氣旺血行，六者合而為臣，使氣血順，陰陽調(diào)。車前子清熱解毒、利尿；益母草活血化瘀，利水調(diào)經(jīng)，二者共用，一泄腎中虛火，二可制約溫?zé)崴幬镏?，三則利水消腫，使水濕得行，邪有出路。桃仁、丹參行血破瘀，使氣血通暢。四者相合為佐藥。縱觀全方，具有“陰陽氣血并調(diào)、肝腎兼顧；補中有通、補中有清”的特點。故有補腎填精、活血化瘀、清利濕熱的功效，可提高男性生殖能力。

研究發(fā)現(xiàn)，強精片能提高精子密度、活力及活率、改善精子形態(tài)[8-9]。基礎(chǔ)研究證實[10]，強精片可改善和調(diào)節(jié)大鼠附睪功能性指標(biāo)，增加附睪重量和管壁厚度，促進(jìn)損傷附睪上皮恢復(fù)和上皮細(xì)胞的分泌，提高睪丸附睪器官系數(shù)，增加附睪液SA含量，降低精子膜GPC含量，從而改善附睪精子成熟功能，起到改善精子質(zhì)量的作用。多項研究顯示[11-12]，強精片能通過下調(diào)Fas/FasL表達(dá)，降低睪丸內(nèi)ABP表達(dá)量，影響Occludin蛋白，控制支持細(xì)胞對生精細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)BTB。強精片可能通過增加精子尾部鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白TUBB、DMHC7、TCTE3的表達(dá)，提高精子活力[13]。同時強精片可增加精液中TGF-β1的表達(dá)量，降低睪丸中波形蛋白的表達(dá)量，上調(diào)Cdyl、G9a表達(dá)，下調(diào)HDAC1表達(dá)，降低睪丸組織細(xì)胞凋亡率，改善模型大鼠受損睪丸結(jié)構(gòu)[14-15]。

五子衍宗丸共五味藥，包括五味子、枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子，方中枸杞子、菟絲子補腎精、壯陽道、助精神；覆盆子養(yǎng)真陰、固精關(guān)、起陽痿；五味子補腎水、益肺氣、止遺泄；車前子利小便，與上述四子相配，補中寓瀉，補而不膩。諸藥相配成方，共奏補腎益精之功。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中補腎法、活血法在臨床治療男性不育癥中均有較好的療效。李海松等[16]分別采用溫陽補腎、滋陰補腎、益腎填精等方法治療男性不育癥均取得令人滿意的臨床療效。國醫(yī)大師何任教授[17]以活血化瘀法治療不育癥亦取得較好的療效。研究發(fā)現(xiàn)[18]，補腎填精、活血化瘀可改善睪丸、附睪功能及精子發(fā)生、成熟的微環(huán)境，促使缺陷精子修復(fù)為正常精子。中醫(yī)學(xué)許多補腎藥具有促性腺激素和性激素樣作用。同時，活血藥也可改善生殖器官局部的血液循環(huán)[7]。以補腎活血為治則的補腎活血育精方、益腎活血方、生精湯可明顯改善腎虛血瘀型男性不育癥的精子質(zhì)量，有效提高精子濃度、精液量、存活率、PR和正常精子百分比，減少患者精液液化時間，降低PAS和DFI[19-21]。

精子DNA是遺傳信息的載體，若精子DNA受損，將會導(dǎo)致精子功能和受精能力下降，甚至發(fā)生不育。對于精子DNA損傷的確切機(jī)制，目前的研究主要包括3個方面：生精過程中的細(xì)胞凋亡、運輸過程中的氧自由基影響及包裝過程中的染色質(zhì)異常。精子DNA的損傷形式主要包括精子DNA碎片、染色質(zhì)包裝異常和魚精蛋白缺乏，其中最主要的損傷形式是精子DNA碎片，包括精子DNA單鏈或雙鏈的斷裂。高水平的ROS影響精子細(xì)胞核中DNA的完整性。不育男性精子DNA碎片明顯增多。當(dāng)精子暴露于人為的ROS環(huán)境中，會造成精子DNA的氧化修飾、DNA鏈的斷裂、交聯(lián)、片段的氧化、產(chǎn)生游離的片段，造成缺失、DNA的染色質(zhì)的重組。氧化應(yīng)激與DNA鏈的斷裂有密切關(guān)系[22]。精子DNA的損傷是多種因素共同作用的結(jié)果，主要包括生殖道的感染、腫瘤，各種化學(xué)、物理因素，生活環(huán)境及習(xí)慣，年齡以及季節(jié)溫度等。臨床上常見的影響精子DNA損傷的生殖系統(tǒng)疾病多見于精索靜脈曲張、睪丸扭傷或創(chuàng)傷、隱睪、睪丸腫瘤、泌尿生殖系炎癥等。SOD是一種含Zn、Cu的酶，是抗氧化酶中重要的一種，也是體內(nèi)主要的自由基清除劑，能抑制自由基引起組織損傷的主要環(huán)節(jié)——脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。因此ROS和SOD對男性不育患者精子DNA損傷有較大的參考價值。

目前臨床已有多種方法可用來改善精子DNA損傷，其中比較常用的治療方法包括抗氧化劑治療、治療感染、睪丸取精、精索靜脈曲張手術(shù)等?？寡趸瘎┛梢灾泻途褐羞^量的ROS，減少ROS含量，避免誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，以減少對精子DNA的損傷。研究表明，對精子DFI偏高的不育患者使用抗氧化劑治療后，精子DFI降低，明顯提高妊娠率[23]。同時現(xiàn)代實驗研究發(fā)現(xiàn)，補腎藥、活血藥中含有很多與生精有關(guān)的微量元素，同時對氧化應(yīng)激損傷也有很大改善。這可能是補腎活血法改善精子DNA損傷的機(jī)制理論依據(jù)。本次研究也證實，治療組使用補腎補血法(強精片)治療前DFI平均值為(25.24±9.76)%，經(jīng)過3個月的治療后，治療組DFI平均值為(10.95±4.55)%，其DFI測值顯著降低；治療組治療前SOD平均值為(14.19±7.15)ng/mL，治療后治療組SOD平均值為(28.01±11.18)ng/mL，SOD平均值較治療前有顯著提高。因補腎活血藥中大部分中藥成分中含有抗氧化物，可中和過多的ROS，提高SOD活性，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，故而減輕精子DNA損傷。

總的來講，補腎活血法(強精片)可清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基，提高人體內(nèi)多種抗氧化酶(包括SOD)的活性，降低體內(nèi)生物分子的氧化產(chǎn)物(包括脂類氧化產(chǎn)物MDA，以及DNA和蛋白質(zhì)的氧化物)，減輕精子DNA鏈的斷裂、交聯(lián)、片段的氧化及缺失，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善精子DNA損傷，從而提高男性不育癥患者的生育能力。