韓倞 劉哲輝 華瑩奇 蔡鄭東

骨肉瘤 (osteosarcoma，OS) 是常見于兒童和青少年的惡性骨腫瘤，其治療方法在 20 世紀 70 年代的截肢手術逐漸演變?yōu)槟壳暗幕熉?lián)合保肢手術，但 5 年生存率依然僅有約 70%[1]。在治療過程中，腫瘤持續(xù)不斷的發(fā)生發(fā)展是克服疾病的主要障礙，而腫瘤的能量代謝異常也成為腫瘤的十大標志之一[2]。近年來有大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的代謝重編程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面起到了重要作用[3-5]。

代謝重編程是腫瘤細胞為在極端微環(huán)境下存活而對其合成和分解代謝進行調節(jié)，以獲得所需能量和物質而進行的過程[3]，該過程主要涉及糖類、脂質、氨基酸、核苷酸等代謝途徑[6]。隨著研究進展，乳酸等以往被認為無用的代謝產物也被發(fā)現(xiàn)參與了重要代謝過程，因此細胞代謝所涉及的范圍也不斷擴大[3]。鑒于越來越多的研究發(fā)現(xiàn)代謝重編程在 OS 的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，筆者綜述了在 OS 中糖代謝、氨基酸代謝和脂質代謝等物質及能量代謝途徑的變化對 OS 發(fā)生發(fā)展的影響。

因此，以“osteosarcoma”、“metabolic OR metabolism”以及糖、氨基酸、脂質代謝過程中的各種酶和代謝產物英文名作為關鍵詞、主題詞，在 PubMed 數(shù)據(jù)庫中檢索，檢索時間截止至 2020 年 10 月，檢索近 5～10 年內的文獻，共 677 篇。設定的納入標準：研究類型為原創(chuàng)研究、綜述、臨床試驗；研究內容與 OS 的代謝重編程相關；對概念、生理過程及物質的分子生物學功能的必要闡釋。排除標準：文章類型為觀點、評述；無法獲得全文。本綜述選取相關文獻 55 篇，圍繞代謝重編程對 OS 發(fā)生發(fā)展的影響進行綜述。

一、糖代謝

作為細胞內重要的代謝物質之一，葡萄糖存在多種合成和分解途徑。糖合成代謝主要包括糖異生、糖原合成；而糖分解代謝主要包括發(fā)生于細胞質的糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑 (pentose phosphate pathway，PPP)、絲氨酸合成途徑以及發(fā)生于線粒體的三羧酸循環(huán) (tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 和氧化磷酸化。其中糖酵解作為核心代謝途徑，將葡萄糖轉化為丙酮酸。丙酮酸隨后可通過無氧酵解產生乳酸并轉運出細胞外，也可進入線粒體氧化產能。糖酵解的中間產物則作為分支代謝途徑的起點：葡萄糖-6-磷酸 (glucose-6-phosphate，G-6-P) 可進入 PPP， 3-磷酸甘油酸可進入絲氨酸合成途徑[6]。

1. 糖酵解：葡萄糖代謝主要有兩種產能方式：有氧氧化和無氧糖酵解。糖酵解是二者的共同通路，1 mol 葡萄糖通過糖酵解分解為 2 mol 丙酮酸，同時產生 2 mol 三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate，ATP)，ATP 是生物體內的直接供能物質。此后隨環(huán)境中氧含量不同，丙酮酸會進入不同的代謝途徑。在有氧環(huán)境中，2 mol 丙酮酸進入線粒體氧化脫羧生成乙酰輔酶 A，隨后進入 TCA cycle，生成的還原性物質煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide，NADH) 和黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體 (flavine adenine dinucleotide，reduced，F(xiàn)ADH2) 經電子傳遞鏈釋放能量，生成大量 ATP，完成氧化磷酸化過程。最終 1 mol 葡萄糖經有氧氧化產生 30 或 32 mol ATP。若是在缺氧環(huán)境下，2 mol 丙酮酸會在細胞質中轉化為 2 mol 乳酸，隨后轉運至細胞外，該過程不產生額外的 ATP。最終 1 mol 葡萄糖通過無氧糖酵解產生 2 mol ATP[7]。

正常細胞增殖程度有限，而腫瘤細胞增殖迅速且不受限制，因此腫瘤細胞必須產生更多能量以滿足其增殖需要。無論氧氣含量是否充足，腫瘤細胞總是傾向于通過無氧糖酵解而非有氧氧化產能 (Warburg 效應)[8]。如前所述，無氧糖酵解產生的能量遠少于有氧氧化，因此腫瘤需要從環(huán)境中攝取更多的葡萄糖。目前已經確認了多種如 Myc、Ras 等癌基因，可通過缺氧誘導因子 (hypoxia inducible factor，HIF) 影響腫瘤的糖代謝水平[9]。在缺氧條件下，HIF-1α 降解減少，葡萄糖轉運體 1 (glucose transporter 1，GLUT1) 表達水平顯著提高，使腫瘤細胞能夠更迅速地攝取葡萄糖。Fan 等[10]檢測了 51 例 OS 標本及其癌旁組織中 GLUT1 及其 mRNA 的表達水平，其中 38 例 (74.5%) OS 標本 GLUT1 表達水平升高而癌旁組織僅有 6 例 (11.8%) 升高，且腫瘤組織 mRNA 水平也顯著高于癌旁組織。Kang、Chen 等[11-12]發(fā)現(xiàn)，抑癌基因長鏈非編碼 RNA (Long noncoding RNA，lncRNA) HAND2-AS1 在 OS 患者的腫瘤組織中表達水平顯著低于癌旁組織，該蛋白能夠抑制 HIF-1α，在 MG-63 和 Saos-2 細胞中沉默該基因后 GLUT1 表達量顯著上升，葡萄糖攝取量增加，OS 患者腫瘤大小也與其 HAND2-AS1 的血清水平呈負相關。

己糖激酶 2 (hexokinase 2，HK2) 是催化糖酵解第一步的限速酶，能將進入細胞的葡萄糖轉化為 G-6-P。在 OS 中已經發(fā)現(xiàn)多種調控 HK2 的代謝通路和物質。Liu 等[13]發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，miR-185 在 OS 組織中的表達水平明顯降低，該物質能夠與 HK2 mRNA 的 3’ 端非翻譯區(qū)結合，阻斷翻譯過程。在 OS 細胞中過表達 miR-185 能相應地下調 HK2 的表達水平，使用 miR-185 抑制物將促進 OS 細胞無氧糖酵解和細胞增殖。Song 等[14]發(fā)現(xiàn) lncRNA PVT1 在 OS 中表達升高，該物質為 miR-497 的內源競爭 RNA (competing endogenous RNA，ceRNA)，能夠競爭性結合 miR-497，進而上調 miR-497 的下游靶點 HK2，促進糖酵解，加速 OS 增殖和侵襲。沉默 PVT1 或過表達 miR-497 均能抑制腫瘤細胞的生長。Han 等[15]發(fā)現(xiàn)了 OS 細胞中高表達的 lncRNA TUG1 可通過上調 HK2 表達提高糖酵解水平，促進 OS 細胞體外增殖；Zhuo 等[16]也發(fā)現(xiàn)了 PI3K / Akt 信號通路可通過上調 HK2 促進 OS 糖酵解，靶向抑制 HK2 表達能夠減少 OS 細胞的體外增殖。

醛縮酶 A (aldolase A，ALDOA) 是催化糖酵解中果糖-1，6-二磷酸轉變?yōu)?3-磷酸甘油醛的酶。Long 等[17]在 MG-63 和 U2OS 細胞系中過表達 ALDOA 后，腫瘤細胞體外侵襲能力顯著增強，基質金屬蛋白酶 2 (matrix metalloproteinase 2，MMP2) 表達量也顯著升高，而敲低后則得到相反的趨勢。將過表達 ALDOA 的 MG-63 細胞移植至裸鼠后與對照組相比，其原發(fā)腫瘤體積更大，肺轉移顯著增加。Shen 等[18]發(fā)現(xiàn) OS 中 IncRNA KCNQ1OT1 表達升高，該物質為 miR-34c-5p 的 ceRNA，可減弱后者靶向抑制 ALDOA 的效果，最終促進了 OS 增殖并抑制其凋亡。Chen 等[19]分析了 40 例 OS 臨床標本，結果表明 ALDOA 表達量高的患者生存時間顯著短于表達量低的患者。

以上研究表明，腫瘤細胞中葡萄糖轉運體及 HK2、ALDOA 等糖酵解相關酶表達水平的升高使 OS 細胞能夠攝取更多葡萄糖并提高其糖酵解水平，以此獲得足夠的能量，滿足腫瘤發(fā)生發(fā)展需求。

2. 磷酸戊糖途徑：除繼續(xù)完成糖酵解外，G-6-P 還可進入分支代謝途徑，即糖酵解。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD) 是該支線途徑的限速酶，決定了糖酵解的水平[7]。糖酵解能夠為細胞生命活動提供核糖和 NADPH，前者是合成核苷酸的原料之一，后者是重要的抗氧化物質[20]。

機體內存在氧化與抗氧化物質的平衡。在生理條件下，活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 主要產生于線粒體活動，因此在氧含量高、胞內葡萄糖水平高的情況下，其生成速率會增加[21]?？寡趸镔|谷胱甘肽過氧化物酶需要消耗還原性谷胱甘肽 (glutathione，GSH) 并將 ROS 還原為無毒化合物，而 GSH 水平的維持則需要消耗 NADPH。因此，NADPH 含量在細胞氧化與抗氧化平衡中起到重要作用。當該平衡被破壞時，就會發(fā)生氧化應激，對細胞造成損傷，引起細胞死亡[22]。Wang 等[23]發(fā)現(xiàn)，在 OS 中表達異常升高的 IncRNA OR3A4 下調了 miR-1207-5p 的水平，減弱了后者對 G6PD mRNA 的抑制效果，因此 OS 中 G6PD 表達水平較正常組織更高。在 MG-63 和 Saos-2 細胞中下調 OR3A4 基因后，G6PD 表達量減少，NADPH 生成量隨之減少，同時細胞內 ROS 水平升高程度與 NADPH 減少程度相一致，OS 細胞的存活率也顯著降低。該研究表明，在 OS 中上調的 OR3A4 基因能夠使磷酸戊糖途徑水平升高，產生更多的 NADPH，保護腫瘤細胞不受氧化應激傷害，從而有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

3. TCA cycle 與氧化磷酸化：正常細胞中葡萄糖經過糖酵解轉化為丙酮酸后，會進入線粒體進行 TCA cycle 與氧化磷酸化。然而在腫瘤中，丙酮酸更多地在細胞質中轉化為乳酸，因此進入線粒體的量則相對減少。在分子水平上，該趨勢則表現(xiàn)為 TCA cycle 與氧化磷酸化相關的酶和輔助因子等物質水平下降[9]。線粒體活動減少帶來的直接影響是 ROS 的產生減少，使腫瘤細胞免受氧化應激損傷，從而有助于發(fā)生發(fā)展[9,21]。Zhang 等[24]對 24 例 OS 患者、19 例良性骨腫瘤患者和 32 例健康對照者的血清和尿液代謝產物進行了分析，結果顯示 OS 患者 TCA 水平下調。

圖1 骨肉瘤的代謝重編程及其潛在治療靶點Fig.1 Metabolic reprogramming of osteosarcoma and its potential therapeutic targets

異檸檬酸脫氫酶 (isocitrate dehydrogenase，IDH) 能夠將異檸檬酸轉化為 α-酮戊二酸，是 TCA cycle 中的關鍵酶。該酶共有 3 個亞型，其中 IDH1 位于細胞質和過氧化物酶中，IDH2 和 IDH3 位于線粒體中[25]。目前已在膀胱癌、腦膠質瘤等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn) IDH 水平與腫瘤進展之間存在聯(lián)系[25-26]。Hu 等[27]發(fā)現(xiàn)，IDH1 在 OS 組織中表達量較正常骨組織更低。在 143B 和 MG63 OS 細胞中上調 IDH1 后，與對照組相比，細胞凋亡率分別增加了 55% 和 29%，同時促凋亡蛋白 Bax 含量上升，抗凋亡蛋白 Bcl-2 含量下降，caspase-3 活性分別為對照組的 1.55 倍和 1.72 倍，侵襲活性減少 48.3% 和 56.2%，同時與細胞遷移和侵襲相關的 MMP-9、ICAM-1 和 VEGF 蛋白表達則被抑制。將過表達 IDH1 的 143B 細胞注射到裸鼠皮下后發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生長速度較對照組明顯減慢，平均重量減少 77.3%。將兩種細胞的 IDH1 敲低，則觀察到了趨勢相反的結果。該研究證實了通過上調 IDH1 的表達在體內外環(huán)境中均能抑制 OS 的進展。Yi 等[28]觀察到，在 44 例 OS 樣本中，惡性程度高的組織中 IDH2 表達量較低。體外實驗中下調 Saos-2 和 MG63 細胞的 IDH2 表達量，6 天后實驗組相比對照組，生長速率分別提高至 1.7 倍和 1.5 倍，侵襲活性分別提高至 2.8 倍和 2.2 倍。進一步機制研究表明，IDH2 下調促進 OS 細胞生長侵襲與 NF-κB 的增加和 MMP-9 的激活有關。前者在炎癥反應、免疫應答等過程中起到關鍵作用，后者能夠降解細胞外基質，促進腫瘤侵襲[29-30]。

Zhu 等[31]發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p 在 MNNG-HOS、U2OS、MG63、Saos-2 四種 OS 細胞中水平升高。下調該物質表達水平后，體外實驗顯示 OS 細胞集落數(shù)量減少，在小鼠皮下成瘤模型上則表現(xiàn)為明顯的腫瘤生長延遲，證明 miR-23b-3p 能夠促進 OS 的增殖。此外，下調 miR-23b-3p 提高了 OS 細胞基礎和最大耗氧率 (反映氧化磷酸化水平的指標) 而降低了基礎和最大細胞外酸化率 (反映糖酵解水平的指標)，且氧化磷酸化產生的 ATP 和糖酵解產生的乳酸也相應地分別升高和降低。進一步機制研究發(fā)現(xiàn) miR-23b-3p 通過直接靶向抑制過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活因子 1α (peroxisome proliferator activated receptor γ coactlvator-1α，PGC1α) 調控氧化磷酸化水平。PGC1α 是一種多功能轉錄輔激活因子，在線粒體穩(wěn)態(tài)和氧化代謝中起到重要作用[32]，其表達量升高可提高氧化磷酸化水 平[33]。上調 PGC1α 增強了氧化磷酸化水平并抑制了 OS 細胞增殖，而下調則逆轉了 miR-23b-3p 下調所產生的影響。以上研究證明了 OS 細胞中 miR-23b-3p 的升高能夠抑制 PGC1α，使氧化磷酸化水平降低，而糖酵解水平增高，最終促進 OS 發(fā)生發(fā)展。

二、氨基酸代謝

腫瘤細胞為了滿足快速增殖的能量需求，除糖代謝所需的能量來源外，氨基酸代謝的需求也有所提高。氨基酸在腫瘤細胞中，除合成細胞必須的蛋白質等基本原料外，還可作為能量代謝的調節(jié)物質[6]。在 OS 中，與代謝重編程相關的研究主要集中在谷氨酰胺代謝方面。

谷氨酰胺是除葡萄糖外腫瘤細胞用以進行能量代謝的代謝物質之一。在腫瘤細胞內，谷氨酰胺脫氨基變?yōu)楣劝彼?，在谷氨酸脫氫酶的作用下變?yōu)?α-酮戊二酸，α-酮戊二酸經過 TCA cycle 后變?yōu)樘O果酸或草酰乙酸，之后可用于合成丙酮酸，進而參與供能或其它物質的合成，腫瘤細胞可通過谷氨酰胺轉運蛋白 (包括 ASCT2、SNAT1、SNAT2、SNAT4、LAT1 等[33])，而這種依賴谷氨酰胺的代謝方式已經成為多種腫瘤的代謝特點[34]。從細胞外攝取谷氨酰胺。Br?er 等[35]的研究表明，OS 細胞系 143B 細胞內丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的合成均依賴谷氨酰胺，并且在谷氨酰胺缺乏時，143B 細胞的生長將完全停止。抑制谷氨酰胺轉運蛋白 SNAT1 / 2 的活性可使 143B 細胞增殖下降，但抑制 ASCT2 并未有類似效果，該研究表明在 143B 細胞系內 SNAT1 / 2 是谷氨酰胺的轉運蛋白，而 ASCT2 等其它轉運蛋白起到氨基酸的交換作用，并根據(jù)此提出腫瘤氨基酸穩(wěn)態(tài)模型[36]。

除轉運蛋白外，谷氨酰胺的代謝酶 (glutam-inase，GLS) 也在谷氨酰胺代謝中起重要作用，Zhang 等[37]的臨床研究表示 GLS 表達水平越高，患者的生存時間相對越低，呈負相關。Ren 等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)過程中剝奪谷氨酰胺后，三種 OS 細胞系 MG63.3、143B、K7M2 的生長速度均顯著降低，體內實驗發(fā)現(xiàn) GLS 抑制劑 CD-839 在小鼠 OS 模型中具有良好的抑制腫瘤生長的效果，而聯(lián)合二甲雙胍可使該效果更佳顯著。

三、脂質代謝

脂質代謝在腫瘤生長中也扮演著重要角色[6]，而目前對 OS 的研究主要集中在脂肪酸代謝相關領域，例如 ATP 檸檬酸裂合酶 (ATP citrate lyase，ACLY)、脂肪酸合成酶 (fatty acid synthase，F(xiàn)ASN) 等。

ACLY 作為脂肪從頭合成的第一個限速酶，將檸檬酸轉化為草酰乙酸以及乙酰輔酶 A，目前已在多種腫瘤中觀察到高表達量 ACLY 對腫瘤生長的促進作用[38-39]。Xin 等[39]發(fā)現(xiàn)較正常組織細胞，OS 細胞 ACLY 表達明顯升高，并且 miR-22 可以在細胞系以及小鼠模型中抑制 ACLY 的功能，抑制腫瘤增殖和侵襲能力。而 FASN 是催化脂肪從頭合成過程最后一步，同時 FASN 也是一個癌基因，在多種腫瘤中表達量均有升高[40]。研究表明，抑制 FASN 對于減緩 OS 的發(fā)生發(fā)展有明顯效果[40-43]。Guo 等[44]發(fā)現(xiàn)核轉錄因子 NF-YA 可通過激活 FASN 信號通路來促進 OS 細胞系的惡性表型。Sun 等[45]在 OS 細胞系中的研究發(fā)現(xiàn) FASN 通過調控 ERK1 / 2 / Bcl-xL 信號通路使 OS 細胞增殖以及遷移增強。Chen 等[46]發(fā)現(xiàn)沉默 FASN 可以降低 HER2 / PI3K / Akt 信號通路相關蛋白表達水平，在小鼠模型內可以抑制 OS 的生長及轉移。

目前，在 OS 細胞脂質代謝的研究還相對缺乏，但 OS 細胞內 ACLY、FASN 等脂肪合成相關酶表達水平與 OS 細胞表型的相關性顯示出了脂質代謝與 OS 發(fā)生發(fā)展的重要聯(lián)系，脂質代謝的相關酶也可能成為治療 OS 的重要 靶點。

總之，代謝重編程在腫瘤發(fā)展、轉移與耐藥中的作用已經得到了越來越多的揭示。增進對腫瘤代謝重編程的理解能夠為腫瘤的治療提供更多策略，目前已有多種靶向腫瘤各種代謝途徑的藥物，如已經批準上市的 mTOR 通路抑制劑 temsirolimus 和 everolimus、進入臨床研究的谷氨酰胺酶抑制劑 CB-839，以及研究中的氧化磷酸化抑制劑二甲雙胍、IDH 和 FASN 靶向抑制劑等[47]，其中部分藥物已在 OS 的臨床試驗中取得一定療效[38,48-50]；除代謝酶和轉運蛋白的直接抑制劑外，靶向腫瘤代謝相關的調節(jié)物也有潛在的治療效果，如 S1PR3 拮抗劑 TY52156 可抑制 S1P / S1PR3 軸減少糖酵解酶 PGAM1 的轉錄[51]、生物提取物 honokiol 可促進 ROS / ERK1 / 2 通路上調葡萄糖調節(jié)蛋白 GRP-78 和 ROS 水平[52]，進而抑制 OS 細胞生長。因此，靶向代謝藥物在 OS 的臨床治療方面具有良好的應用前景，但目前的研究多數(shù)仍處于機制水平，尚缺乏大量高級別有效證據(jù)，臨床療效證據(jù)不足，且部分受限于其安全性[53]。盡管靶向腫瘤代謝能夠有效地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但單一代謝通路抑制的治療方法也存在某些缺陷，包括忽略了腫瘤的異質性和代謝適應現(xiàn)象，例如同一腫瘤組織中既有依賴無氧糖酵解的腫瘤細胞，也有依賴氧化磷酸化的腫瘤細胞；糖代謝途徑被抑制的腫瘤可以轉向依賴谷氨酰胺等其它代謝物質[54]。因此，未來靶向代謝治療方案可能需要在針對腫瘤代謝特征的同時對多種代謝通路進行抑制，以在確保安全性的同時，獲得對 OS 有特效的、更加理想的治療效果[55]。