李珅瑀，賈祥子，郭君陶，張清霞，陳夕軍

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

水稻是亞洲許多國家的主糧。亞洲水稻的種植面積占世界總面積的90%，而我國水稻的種植面積居世界第2 位。稻瘟病是由稻瘟病菌（Pyricularia oryae）引起的一種真菌病害，具有突發(fā)性強(qiáng)、傳播迅速、易于流行等特點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，平均每年造成的水稻產(chǎn)量損失可達(dá)30%～50%，嚴(yán)重時(shí)顆粒無收[1]。目前，施用化學(xué)農(nóng)藥和采用抗病品種是防治稻瘟病的主要方式，但抗病品種存在選育時(shí)間長、抗病性易喪失等問題，長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，還危害生態(tài)環(huán)境和人畜健康。生物防治因具有無殘留、對人畜和天敵安全、與環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)[2]，更有利于恢復(fù)與重建以自然調(diào)控為核心的生態(tài)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)水稻植株生態(tài)系統(tǒng)的平衡，近年來，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。

目前，對稻瘟病有良好拮抗作用的生防微生物有多種，不同生防菌作用方式不同。ALI 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，木霉（Trichodermasp.）可通過溶解稻瘟病菌菌絲細(xì)胞壁使菌絲卷曲來降低稻瘟病菌的致病性。DE VLEESSCHAUWER 等[4]研究表明，Pseudomonas fluorescensWCS374r 可引發(fā)水稻產(chǎn)生ISR 增強(qiáng)抗葉瘟的能力。通過突變體分析證實(shí)，P.fluorescensWCS374r誘導(dǎo)的ISR 依賴茉莉酸/乙烯信號傳導(dǎo)通路，不依賴水楊酸。YU 等[5]分離的葡萄球菌（Staphylococcussp.）可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)嘌呤核苷磷酸化酶，顯著抑制孢子的萌發(fā)、附著胞的形成，從而預(yù)防稻瘟病。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)啉氨甲基醋酸，可抑制稻瘟病菌菌絲的生長和孢子萌發(fā)[6]。芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢在環(huán)境中可與其他微生物互作，具有極強(qiáng)的抗逆性和廣譜抑菌活性，并誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性[7]。

本研究為確定生防細(xì)菌5-8 對水稻稻瘟病的防治效果，在對揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的10 株生防菌進(jìn)行苗期防病試驗(yàn)后，又通過16S rDNA 基因序列同源性分析及生理生化指標(biāo)測定對生防細(xì)菌5-8 進(jìn)行菌種鑒定，通過PCR 擴(kuò)增及MALDI-TOF MS 檢測確定菌株5-8 產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，通過孢子萌發(fā)及對細(xì)胞膜的破壞試驗(yàn)確定其抗菌作用方式，旨在為今后防治稻瘟病提供更為新型、優(yōu)異的生防資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以感稻瘟病品種武育粳3 號為供試水稻品種。對揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的拮抗細(xì)菌5-8、綠針假單胞菌（Pseudomonas choloeaphtis7-5）[8]、50、JY1-5、DC1、29、53、55、HTC-1、HTC-5 進(jìn)行測試，以抑菌譜廣的Bacillus amyloliquefaciensW10[9]為陽性對照。

供試病原真菌：水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、稻瘟病菌（Pyricularia oryae）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）、桃枝枯病菌（Phomopsis amygdali）、棉立枯病菌（Rhizoctonia solani）、瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.radicislycopersic）、茭白胡麻斑病菌（Helminthosporium zizaniae）。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH 值自然；稻稈粉培養(yǎng)基為水稻秸稈或稻殼30%～40%、棉籽殼30%～40%、豆粕2%～7%、麥麩7%～15%、米糠7%～15%、玉米粉3%～9%、生石灰0.5%～3%[10]；LB 培養(yǎng)基為胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH 值7.2～7.4。

1.2 苗期防病試驗(yàn)

將水稻品種武育粳3 號種子經(jīng)1%H2O2浸泡1 d后，用30 ℃清水浸泡2 d。待絕大多數(shù)種子發(fā)芽后分別播于育秧盤，一個盤40 穴，每穴3 株，每10 穴一個重復(fù)，每個處理3 次重復(fù)。稻瘟病菌孢子制備參照周益軍等[11]的方法，將稻瘟病菌在產(chǎn)孢培養(yǎng)基（稻稈粉培養(yǎng)基）上培育7 d，黑光燈照射處理3 d，將分生孢子洗脫，配成106個/mL 的孢子懸浮液備用。

將新活化的供試生防細(xì)菌接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃170 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，直接用細(xì)菌懸浮液噴霧處理水稻秧苗，24 h 后再用稻瘟病菌孢子懸浮液噴霧接種，接種后移至溫室內(nèi)，再用塑料薄膜覆蓋保溫保濕，7～10 d 調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

1.3 抑菌譜測定

將直徑0.5 cm 病原菌菌碟接種于PDA 平板中央，取3 μL 的細(xì)菌懸浮液接種于距離培養(yǎng)皿邊緣10 mm 處，置25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～15 d，測定抑菌帶寬。每處理3 次重復(fù)。

1.4 菌株鑒定及數(shù)據(jù)處理

CTAB/NaCl 法提取菌株5-8 基因組DNA。采用16S rDNA 保守引物16S-63F 和16S-1387R（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，30 個循環(huán)；55 ℃退火15 s；72 ℃延展1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物直接送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。采用BLASTn 在GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列搜索，用MEGA 5.0 軟件進(jìn)行多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析（鄰接法），并用Bootstrap 軟件對進(jìn)化樹進(jìn)行1 000 次可信度分析。

接種新活化的5-8 單菌落，28 ℃振蕩培養(yǎng)至麥比濁度為1.80～2.20 MCF，將BCL 卡（VITEK）和試管菌液放入VITEK-2 Compact 30 全自動微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)，對菌株5-8 進(jìn)行生理生化特征分析。

1.5 生防作用機(jī)制分析

1.5.1 拮抗細(xì)菌5-8 抗生素合成相關(guān)基因檢測 據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌屬細(xì)菌通常采用非核糖體途徑產(chǎn)生豐原素、伊枯草菌素和表面活性素等脂肽類物質(zhì)[12]，因此試驗(yàn)以菌株5-8 基因組為模板，利用表1 中的引物fenB-F/fenB-R、IturinA-F/IturinA-R、Surfactin-F/Surfactin-R 擴(kuò)增豐原素、伊枯草菌素和表面活性素的保守區(qū)序列，PCR 采用標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)條件，退火溫度分別為53 ℃（fenB）、43 ℃（ituA）、46 ℃（sfp），使用1%瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.5.2 脂肽化合物提取及質(zhì)譜檢測 取新活化的5-8 單菌落接種于200 mL 的LB 培養(yǎng)液中，28 ℃避光振蕩培養(yǎng)2 d，4 ℃、5 000 r/min 離心30 min，收集上清液。將上清液倒入三角瓶，加入6～7 mol/L 的HCl，調(diào)節(jié)至pH=2，4 ℃過夜沉淀。將液體在4 ℃、5 000 r/min 離心30 min，收集沉淀。取50 mL 的甲醇萃取沉淀8 h，4 ℃、5 000 r/min 離心30 min，收集上清液。用同樣方法萃取兩次，合并上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA N-1300）旋蒸得到粗提物，使用1～2 mL 的甲醇溶液溶解粗提物并用直徑0.2 μm 偏氟乙烯膜過濾，獲得粗提液[13]。

質(zhì)譜分析在揚(yáng)州大學(xué)測試中心完成，質(zhì)譜儀器為5800 MALDI/TOF/TOF 串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（AB SCIEX，USA）。點(diǎn)樣的樣品為真空離心濃縮后以50%乙腈、50%水和0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液復(fù)溶。樣品與基質(zhì)（α-氰基-4-羥基肉桂酸，CHCA）以“基質(zhì)-樣品-基質(zhì)”的順序夾心點(diǎn)樣，待自然干燥后進(jìn)行靶標(biāo)分析?；|(zhì)工作液溶劑包含0.1%三氟乙酸，50%乙腈配制的基質(zhì)（CHCA）飽和溶液。激光源為200 Hz（355 nm 波長）的Nd：YAG 激光器，加速電壓為20 KV。MS 采集模式為反射正離子模式，質(zhì)量為800～4 000 Da。采用Default 方式處理樣品點(diǎn)。先用多肽標(biāo)準(zhǔn)品（AB SCIEX，USA）進(jìn)行內(nèi)標(biāo)校正，再進(jìn)行采集，每個圖譜采集4 000 shots。

1.5.3 活性物質(zhì)對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)率的影響 將得到的脂肽粗提物使用60 ℃金屬浴烘干并稱重。將不同濃度的脂肽粗提物（0、1.0、1.5、2.0 mg/mL）加入含有稻瘟病菌分生孢子的PDB 培養(yǎng)液制成孢子懸浮液，以等體積的甲醇溶液做對照，得到終濃度為105個/mL 孢子。放至28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)芽管長度大于病菌分生孢子直徑時(shí)，視為孢子萌發(fā)。用目鏡測微計(jì)Primostar176045-fed 微目鏡測量孢子萌發(fā)率。每個重復(fù)中測定大約100 個孢子，每個處理設(shè)3 次重復(fù)。

1.5.4 細(xì)胞膜完整性測定 本研究采用熒光碘化丙啶（PI）檢測細(xì)胞膜完整性。將稻瘟病菌孢子加入含有不同濃度脂肽粗提物（0、1.0、1.5、2.0 mg/mL）的PDB 培養(yǎng)基，25 ℃靜置培養(yǎng)4 h，4 000 r/min 離心5 min 收集孢子，室溫下用0.01 g/L PI 染色30 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，并在OLYMPUS BS53C 熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）下觀察（PI 激發(fā)波長：535 nm，發(fā)射波長：615 nm）。每個處理隨機(jī)選擇100 個孢子，重復(fù)3 次。孢子膜的完整性根據(jù)以下公式計(jì)算

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用唐啟義等[15]DPS 6.55 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的LSD多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌對苗期稻瘟病防效測定

溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，對照的病情指數(shù)為61.11，菌株DC1、JY1-5、55、53、HTC-5、29 和B.amyloliquefaciensW10 的病情指數(shù)均在40.00 以上，且與對照差異不顯著（P＞0.05）。菌株5-8的病情指數(shù)最低為4.90，防病效果達(dá)90%以上，其次是P.chlororaphis7-5，該細(xì)菌的病情指數(shù)為26.53，防效可達(dá)56.5%，且兩種細(xì)菌處理均與對照差異顯著（P＜0.05）。由此可見，菌株5-8的防病效果最好，后續(xù)工作主要針對菌株5-8 進(jìn)行深入研究（圖1）。

圖1 拮抗細(xì)菌對水稻稻瘟病的防病效果

2.2 抑菌譜的測定

菌株5-8 抑菌譜廣，對桃褐腐病菌和油菜菌核病菌抑菌能力最強(qiáng)，抑菌帶寬分別為1.83 cm 和1.80 cm，其次為桃枝枯病菌、瓜果腐霉病菌和黃瓜枯萎病菌，抑菌帶寬分別為1.15、1.14、1.08 cm，對小麥赤霉病菌和棉立枯病菌抑菌效果最差（表2）。

表2 菌株5-8的抑菌譜測定 單位：cm

2.3 菌株5-8的種類鑒定

將菌株5-8的16S rDNA 基因序列在GenBank中比對分析，結(jié)果表明，與B.subtilis的s127e、B.amyloliquefaciensSSH100-3 及B.velezensisTY190-16相似度均達(dá)到99%以上，可初步判定菌株5-8 屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌，其16S rDNA 序列登錄號為MT584667。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，菌株5-8 與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensisCR-502（AY603658）處于同一分支（圖2）。

圖2 菌株5-8 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

在LB 固體培養(yǎng)基表面菌株5-8 菌落呈乳白色，粗糙、邊緣略有不規(guī)則，革蘭氏染色陽性。在15～45 ℃及6.5%的NaCl 溶液中可生長，氧化酶呈陽性，可利用糖原、麥芽三糖、D-葡萄糖、D-甘露糖等，不能利用D-松二糖和D-松三糖，不能水解吐溫20。這些指標(biāo)符合貝萊斯芽孢桿菌生理生化特征（表3）。結(jié)合菌株5-8 16S rDNA 基因序列同源性分析和生理生化指標(biāo)測定結(jié)果，初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）[16]。

表3 菌株5-8 生理生化指標(biāo)

2.4 抗生素合成相關(guān)基因的PCR 檢測

脂肽類抗生素合成基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖3），菌株5-8 基因組中可擴(kuò)增到1 400 bp 的fenB基因、1 200 bp 的ituA基因，未擴(kuò)增到sfp基因，說明該細(xì)菌可能產(chǎn)生豐原素、伊枯草菌素，不能產(chǎn)生表面活性素。

圖3 菌株5-8 抗生素合成相關(guān)基因的PCR 檢測

2.5 抗菌活性物質(zhì)質(zhì)譜分析

根據(jù)MALDI-TOF MS 檢測一級質(zhì)譜圖譜顯示（圖4），強(qiáng)度最大的峰主要集中在1 050～1 100 m/z，此范圍內(nèi)主要峰包括m/z1 065.5、m/z1 079.6、m/z1 081.5、m/z1 095.5。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其中m/z1 065.5和m/z1 079.6 的峰分別為C14-IturinA ［M+Na］+和C15-IturinA［M+Na］+；m/z1 081.5 和m/z1 095.5 的峰分別為C14-IturinA［M+K］+和C15-IturinA［M+K］+。脂肽抗生素通常以同系物的形式存在，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品分子量的大小，最終明確m/z1 065.5、m/z1 079.6、m/z1 081.5、m/z1 095.5 分別為C14-IturinA［M+Na］+、C15-IturinA［M+Na］+、C14-IturinA［M+K］+、C15-IturinA［M+K］+。初步判定菌株5-8 產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)為iturin A 及其同系物[17]。

圖4 抗菌物質(zhì)MALDI-TOF MS 檢測一級質(zhì)譜圖譜

2.6 抗菌活性物質(zhì)對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)的影響

不同濃度的粗提物對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)有不同程度的影響，1.0 mg/mL 的活性物質(zhì)不能抑制稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)，用1.5 mg/mL 的活性物質(zhì)處理后，分生孢子萌發(fā)率約為50%，添加2.0 mg/mL 的活性物質(zhì)可完全抑制分生孢子萌發(fā)（圖5）。

圖5 抗菌活性物質(zhì)對分生孢子萌發(fā)的影響

2.7 抗菌活性物質(zhì)對分生孢子細(xì)胞膜的破壞

用PI 法測定了抗菌活性物質(zhì)對細(xì)胞膜完整性的影響。PI 是一種常用的細(xì)胞核熒光染料，不能穿透細(xì)胞膜而被排斥在活細(xì)胞外，但是可以穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色，并能發(fā)出紅色熒光。不同濃度的抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌分生孢子細(xì)胞膜有不同程度的破壞，細(xì)胞膜的完整性與抗菌活性物質(zhì)濃度呈負(fù)相關(guān)，且各處理與對照相比差異均顯著（P＜0.05）。當(dāng)抗菌活性物質(zhì)濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞膜完整性失膜率最高，達(dá)到34%（圖6）。

圖6 抗菌活性物質(zhì)對細(xì)胞膜完整性的影響

3 結(jié)論與討論

已報(bào)道的生防細(xì)菌中，有較多關(guān)于芽孢桿菌屬細(xì)菌的研究，該屬細(xì)菌抑菌譜廣、能產(chǎn)生大量的次生代謝物，且具有良好的抑制植物病原物生長的能力，因此，許多芽孢桿菌在生物防治和作為糧食產(chǎn)量增產(chǎn)劑上發(fā)揮重要作用。已報(bào)道的生防芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）等，而芽孢桿菌（B.velezensis）是2005年由RUIZ-GARCíA[16]新命名的芽孢桿菌種，中文名為貝萊斯芽孢桿菌，近年來此類生防菌的報(bào)道日益增加。本研究拮抗細(xì)菌中篩選到一株對稻瘟病防病效果好的生防菌5-8，通過16S rDNA 基因序列同源性分析和生理生化指標(biāo)測定將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。

目前，芽孢桿菌屬細(xì)菌對病原菌的生防機(jī)制研究較多，如競爭作用、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性。其中，次生代謝產(chǎn)生的抗生素及揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生的拮抗作用是生防細(xì)菌最主要的抗菌機(jī)制。該屬細(xì)菌能產(chǎn)生非核糖體途徑的脂肽類抗生素，如表面活性素、豐原素和伊枯草菌素；核糖體途徑合成的肽類抗生素，如類羊毛硫抗生素和枯草菌素等[18-19]。此外，該屬細(xì)菌還可產(chǎn)生抗菌蛋白、吲哚-3-乙酸、嗜鐵素和NH3[20-21]。HONMA 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌含有表面活性素和plipastatin 的編碼基因，它們分別顯示較強(qiáng)的抗細(xì)菌和抗真菌活性。LIM 等[23]從菌株G341 中分離出兩種抗真菌化合物，并通過MS/MS分析鑒定為桿菌霉素L 和fengycinA。此外，菌株G341 產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物能夠抑制各種植物病原真菌的菌絲生長。XU 等[24]從B.velezensisZJ20 中提取的β-葡聚糖酶粗酶液可抑制楊樹紫紋羽病菌菌絲的生長。B.velezensisB6 對黃瓜枯萎病和辣椒根腐病具有良好的防治效果。此外，B.velezensisB6可以抑制多毛蟲的繁殖，并延緩黃曲霉中尖孢鐮刀菌的傳播，以抑制病害的擴(kuò)展[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，B.velezensis基因組中具有fenB和ituA基因，但活性物質(zhì)經(jīng)MALDI-TOF 檢測，只得到產(chǎn)生伊枯草菌素的離子峰，可能目前的培養(yǎng)條件不利于豐原素產(chǎn)生。

已有報(bào)道指出，枯草芽孢桿菌T429[26]、側(cè)孢短芽孢桿菌[27]、短小芽孢桿菌[28]等均對水稻稻瘟病有一定的防治效果。本研究測定了菌株5-8 代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌的抑制作用，提取的伊枯草菌素濃度為1.0、1.5、2.0 mg/mL 對稻瘟病菌孢子的萌發(fā)均有一定的影響，以2.0 mg/mL 抑制作用最強(qiáng)，孢子完全不萌發(fā)，為該細(xì)菌代謝產(chǎn)物田間應(yīng)用提供重要參考。