舍玲，丁永年，紀文靜，阿孜古力·阿不來提

新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化科，烏魯木齊830011

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是一種由遺傳-環(huán)境-代謝應激相關因素所致的以肝細胞內脂肪堆積為主要表現(xiàn)的臨床病理綜合征［1］。NAFLD的發(fā)病機理尚不清楚，但已知脂質的合成和代謝在其發(fā)病中起著重要作用［2］。在肝臟中，固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）是脂質代謝的關鍵調控者，可調控與脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TG）合成相關的靶基因，如硬脂酰輔酶A 去飽和酶（SCD1）、脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）等，激活脂質合成的轉錄過程［3］。脯氨酰寡肽酶（POP）是一種可以裂解短肽中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，參與多肽的成熟和降解，可調控炎癥因子、細胞增殖、分化、凋亡等［4-6］。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，在單純脂肪變細胞及NAFLD 動物模型中POP 表達增高，提示POP在NAFLD 進展中起重要作用，但具體調節(jié)機制尚待進一步研究。2019年11月1日—2020年12月1日，本研究觀察了POP 抑制劑S17092 對脂質超載人肝細胞株LO2 脂質沉積的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑 人肝細胞株LO2購自購自中國科學院細胞庫。POP 抑制劑S17092 購自上海源葉生物科技有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液購自Hyclone 公司，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司，棕櫚酸鈉（P9767）、油酸鈉（O7501）、油紅O 試劑盒購自Sig?ma-Aldrich 公司，GAPDH 抗體購自美國Santa Cruz公司，POP 抗體購自Abcam 公司，蛋白提取試劑盒、蛋白檢測試劑盒購自凱基生物公司，甘油三酯試劑盒購自中生北控生物技術有限公司，SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒及組織細胞RNA 微量提取試劑盒購自索萊寶公司，SYBR Green 熒光實時定量PCR 試劑盒購自Life Technologies，RT-PCR 試劑盒購自TaKa?Ra 公 司，AcSDKP ELISA 試 劑 盒 購 自SPI Bio and CEA公司，PCR引物由生工生物工程公司合成。

1.2 脂質超載模型制備、分組及POP 抑制劑給予方法 參照文獻［9］方法，將LO2 細胞在含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d 更換一次培養(yǎng)基，待細胞處于良好生長狀態(tài)且長至80%匯合時，將配置好的油酸和棕櫚酸（2∶1）的混合物按1 mmol/L加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，建立脂質超載模型。綜合前期試驗結果及相關文獻［8］，本研究選擇10μg/mL S17092 處理細胞。將LO2 細胞隨機分為3 組，對照組LO2 細胞用1%無FFA 的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組LO2 細胞制備脂質超載模型后再用1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗組LO2 細胞制備脂質超載模型后再加入含S17092 的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.3 各組細胞內脂質沉積觀察 采用油紅O 染色法。將三組細胞用PBS 洗滌3 次并用4%多聚甲醛固定15 min，然后再用PBS 沖洗3 次，加入丙二醇試劑，室溫下脫水5 min，然后用新鮮稀釋的油紅O 溶液染色10 min，將細胞用60%異丙醇洗滌兩次，每次1 min，用水沖洗，并用蘇木精復染30 s，用PBS 洗滌后，顯微鏡下觀察細胞內脂質沉積情況。

1.4 各組細胞內TG 檢測 采用Bio-Rad 蛋白質測定法。取三組細胞，PBS洗滌兩次后，用0.25%胰酶消化，添加100μL 細胞裂解緩沖液孵育10 min 后離心5 min，收集上清液，按照TG 測定試劑盒說明書要求檢測細胞內TG。實驗重復3次，取平均值。

1.5 各 組 細 胞 內POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取三組細胞，提取RNA 后反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH 為內參，配置20 μL 的PCR 反應液，于實時熒光定量PCR 儀上進行PCR 反應。PCR反應條件：50 ℃2 min、95 ℃2 min 預變性，95 ℃15 s、60 ℃15 s、72 ℃1 min，40個循環(huán)。引物序列如下：POP 正 向 引 物 為5′-CATCTCCCAAGAGGCT?GACTA-3′，反向引物為5′-GGGCAATAACACAAC?CAAAGA-3′；SREBP-1c 正 向 引 物 為 5′-GA?CAGCCCAGTCTTTGAGGA-3′，反向引物為5′-CAG?GACAGGCAGAGGAAGAC-3′；FAS 正向引物為5′-TTCCGAGATTCCATCCTACG-3′，反 向 引 物 為5′-AGGCTCACAAACGAATGGAC-3′；ACC1 正向引物為5′-TCACACCTGAAGACCTTAAAGCC-3′，反向引物 為5′-AGCCCACACTGCTTGTACTG-3′；SCD1 正向引物為5′-TTCCTACCTGCAAGTTCTACACC-3′，反 向 引 物 為5′-CCGAGCTTTGTAAGAGCGGT-3′；GAPDH 正 向 引 物 為 5′-GAAGGTGAAGGTCG?GAGTC-3′，反 向 引 物 為5′-GAAGATGGTGAT?GGGATTTC-3′。以2-ΔΔCt法表示細胞中目的mRNA的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞內脂質沉積情況比較 油紅O 染色結果顯示，與對照組相比，模型組LO2細胞內含有大量的紅染顆粒，而實驗組較模型組紅染顆粒相對較少，見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察油紅O染色的LO2細胞（×200）

2.2 各組細胞內TG 水平比較 對照組細胞內TG水平為（1.995 ± 0.221）pmole/μL，模型組細胞內TG 水平為（2.910 ± 0.030）pmole/μL，實驗組細胞內TG 水平為（2.573±0.113）pmole/μL，組間相比，P均<0.05。

2.3 各 組 細 胞 內POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 相對表達量比較 各組細胞內POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 相對表達量比較見表1。由表1 可知，與對照組相比，模型組、實驗 組 細 胞 中POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD 1 mRNA 相對表達量明顯升高（P均<0.05）；與模型組 相 比，實 驗 組 細 胞 中POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 相對表達量明顯降低（P均<0.05）。

表1 各組細胞內POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA相對表達量比較（±s）

表1 各組細胞內POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

組別實驗組模型組對照組POP mRNA 1.369±0.0819*#1.595±0.040*1.060±0.021 SREBP1c mRNA 1.381±0.083*#2.626±0.066*1.043±0.032 FAS mRNA 1.639±0.113*#2.955±0.095*1.051±0.019 ACC1 mRNA 1.376±0.045*#1.821±0.066*1.062±0.036 SCD1 mRNA 1.311±0.019*#1.869±0.109*1.073±0.014

3 討論

近年來，隨著肥胖等代謝性疾病的增加，NAFLD的發(fā)病率明顯增高。研究［11］發(fā)現(xiàn)，NAFLD是終末期肝病和肝癌的重要病因，即使是肝臟輕度脂肪變性，也會增加71%的死亡風險，而高循環(huán)FFA濃度可通過破壞NAFLD 患者的脂質代謝而加重肝臟脂肪的積累［12］，因此研究FFA 如何影響代謝調節(jié)將進一步增進我們對NAFLD 發(fā)病機制的了解。本研究的目的是在FFA 誘導的脂質超載細胞模型中研究POP抑制劑對NAFLD 的影響，這可能有助于闡明與疾病進展有關的機制。在正常人和NAFLD 患者中，棕櫚酸和油酸都是肝甘油三酯中最豐富的FFA。根據(jù)GOMEZ-LECHON 等的報告，載有含油酸/棕櫚酸（比例為2∶1）的FFA（1 mmol/L）混合物的肝細胞模擬了人類的肝臟慢性脂肪變性［9］。因此，我們通過將LO2 細胞與1 mmol/L FFA 一起孵育，建立了細胞脂肪變性的脂質超載模型，油紅O 染色顯微觀察可見細胞內脂質液泡中大量脂質沉積證實了建模成功。

目前研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，POP 與糖尿病、多發(fā)性硬化、肝硬化、抑郁癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥相關，在肝臟中發(fā)現(xiàn)POP 可促進肝臟的再生和修復。此外有研究［13］表明，POP 可作為肝硬化嚴重程度的評估指標。而ZHANG 等［7-8］研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導的NAFLD模型中POP表達上調，抑制POP可降低肝脂肪變性的嚴重性和炎癥反應，而抑制POP 對肝臟炎癥的保護作用與基質金屬蛋白酶（MMPs）和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（PGP）的產(chǎn)生受抑制以及嗜中性粒細胞浸潤的抑制有關。而另一項細胞實驗［15］表明，POP 過表達可導致Smad7 蛋白和PPAR-γ 上調，減弱大鼠肝星狀細胞的活化，進而延緩肝纖維化。目前POP 在肝臟脂肪變性過程中的機制尚未闡明。一般認為，脂肪肝是由肝臟攝取FFA、TG 合成和排泄之間的不平衡引起的，與脂質代謝相關基因失調密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組POP mRNA 相對表達量更高，而實驗組則表現(xiàn)出細胞脂肪變性減輕。SREBP-1c 是調節(jié)肝臟新生脂肪形成的最重要轉錄因子，可以通過調節(jié)內源性TG、膽固醇、FFA 等合成所需的酶的表達來維持脂質的動態(tài)平衡。SREBP-1c 及其靶基因的異?？梢鹨葝u素抵抗、糖尿病、心臟功能障礙、血管并發(fā)癥和肝脂肪變性等一系列代謝性疾病。研究［16］發(fā)現(xiàn)，NAFLD 患者肝臟內的SREBP-1c 含量明顯升高，表明SREBP-1c在NAFLD 發(fā)生進展中起重要作用。本研究中，F(xiàn)FA 刺激下的L02 細胞中SREBP-1c 基因表達顯著上升，其調控的靶基因FAS、ACC1、SCD1 的表達同步上調，細胞內TG 含量亦增加，并伴有肝細胞內大量脂滴生成，表明SREBP-1c基因表達的上調啟動了相關脂質生成的級聯(lián)過程，促進NAFLD 的發(fā)生及進展。而與模型組比較，實驗組肝LO2 細胞抑制POP 后，內源性長鏈脂肪酸合成的關鍵基因SREBP-1c及其靶向基因FAS、ACC1、SCD1 mRNA相對表達量亦顯著降低，細胞內TG含量和脂滴的生成減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，在L02 細胞中進行FFA 處理導致脂質蓄積可能是由POP介導的，而SREBP-1c及其靶基因FAS、ACC1、SCD1 相對表達量升高是POP誘導脂肪變性的機制的重要組成部分。

總之，POP 抑制劑S17092 可改善脂質超載LO2細胞的脂質沉積，其機制可能與抑制SREBP-1c及其靶基因的表達有關。細胞中POP 表達與脂肪合成相關基因之間的密切關系可能是治療干預NAFLD的潛在目標。然而，POP 促進肝脂肪變性的確切機制仍有待闡明。