李遠(yuǎn)志 王鈞冬 岳朝馳 龍 慶 李 俊

1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，四川瀘州 646000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脾胃病科，四川成都 610000

結(jié)腸癌是全球第三大常見的惡性腫瘤和第四大癌癥死亡原因[1]。目前結(jié)腸癌的主要治療方式是手術(shù)輔以放療或化療，然而患者的5年生存率僅為65.2%[2]，表明目前的治療方法無法根除癌細(xì)胞。因此，急需尋找新的治療結(jié)腸癌的有效方法。中藥半枝蓮的主要活性成分野黃芩苷，是一種主要由肽多糖等構(gòu)成的黃酮類化合物，具有抗腫瘤的作用[3-4]。野黃芩素作為野黃芩苷的苷元，更易吸收，生物活性更高，生物利用度更好[5]，但其抗結(jié)腸癌作用及相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少。因此，本研究擬探索野黃芩素在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制，為野黃芩素在臨床治療結(jié)腸癌提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人結(jié)腸癌細(xì)胞系T84 購(gòu)買于上海北諾生物科技有限公司；15 只雄性無胸腺BALB/C 裸鼠，SPF 級(jí)，5～6 周齡，體重18～20 g，購(gòu)買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030。裸鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，12 h 明暗周期自動(dòng)交替，采取自由采食，自由飲水的方式喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)已報(bào)備醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.1.2 主要試劑及耗材 本研究所需要的試劑及耗材購(gòu)買均來源于北京傲銳東源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 將野黃芩素溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，制成100 mM 的母液備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) T84 細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清、2.5 mM 谷氨酰胺的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為溫度37℃，CO2濃度5%，間隔一天更換細(xì)胞液直至細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染之前的24 h，按照密度為5×105/mL 的標(biāo)準(zhǔn)在24 孔培養(yǎng)瓶中進(jìn)行細(xì)胞接種，采用脂質(zhì)體lipofectamine 2000 將對(duì)照載體和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到T84 細(xì)胞里，隨后對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率則進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Western Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞加入100 μL 計(jì)量的RIPA 裂解液，裂解、變性，同時(shí)經(jīng)BCA定量，隨后取蛋白20 μg 進(jìn)行電泳分離，后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉液中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)1 h 的常溫封閉，4℃環(huán)境下一抗過夜孵育，清洗，之后對(duì)二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)1 h 的室溫孵育，同時(shí)化學(xué)熒光顯色。內(nèi)對(duì)照為GAPDH。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）采用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的總RNA，后將其逆轉(zhuǎn)成cDNA 后按照試劑盒相關(guān)說明進(jìn)行RT-PCR，后采用2-Ct 方法對(duì)mRNA 的含量進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列如下。EGFR-正向引物：5′-CCCTCCTGAGCTCTCTGAGT-3′，EGFR-反向引物：5′-GTTTCCCCCTCTGGAGATGC-3′；GAPDH-正向引物：5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCCG-3′，GAPDH-反向引物：5′-CCTAGCCTCCCGGGTTTCTC-3′。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞使每組細(xì)胞不少于3×105個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，冰浴PBS 清洗2 遍，1000 r/min 離心5 min，留取細(xì)胞沉淀，每組加入1×Annexin V Binding Buffer 100 μL，充分混勻細(xì)胞，將5 μL FITC Annexin V 染液，5 μL PI 染液加入到每組細(xì)胞中，避光室溫反應(yīng)，時(shí)長(zhǎng)15 min，然后每管加300 μL 1×Annexin V Binding Buffer 溶液，1 h 流式細(xì)胞儀檢測(cè)[6]。

1.2.7 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 調(diào)整T84 細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，將懸浮液均勻后的200 μL 細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行接種，等到細(xì)胞貼壁之后，加入濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L 的野黃芩素，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，5 個(gè)復(fù)孔/組。在分別24、48、72 h 培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)后，對(duì)培養(yǎng)基（200 μL 計(jì)量）進(jìn)行更新，同時(shí)加入濃度為5 g/L 的MTT 溶液20 μL 孵育4 h，舍棄上清，加入DMSO 200 μL 后震蕩10 min，測(cè)定吸光度A（波長(zhǎng)處為570 nm），對(duì)半數(shù)抑制濃度（IC50）進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞增殖抑制率=（1-A藥物組/A空白組）×100%。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用不含血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基制成1×106個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，加入6 孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)用無菌20 μL 的白槍頭垂直劃出3 道直線，后加藥物處理，觀察細(xì)胞的愈合情況。劃痕后0 h 和24 h拍照。

1.2.9 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 ①包被基底膜：先按Matrigel 膠1 倍，培養(yǎng)基3 倍配制Matrigel膠稀釋液，后取40 μL Matrigel 膠稀釋液將Transwell小室底部膜的上室包被，4℃環(huán)境下風(fēng)干[7]。②接種細(xì)胞：將T84 細(xì)胞用不含血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整到2×105/mL，于Transwell 小室上室中加入200 μL 細(xì)胞懸液，同時(shí)取600 μL 含20% FBS 的完全培養(yǎng)基加入到24 孔板下室，之后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)48 h 的細(xì)胞培養(yǎng)[8]。③結(jié)果判斷：48 h 后將Transwell 膜棄去上清，PBS 沖洗3 次；冷的無水甲醇固定10 min，空氣干燥，結(jié)晶紫染色5 min；用棉簽將上層未遷移細(xì)胞擦去，PBS 沖洗3 次[9]；顯微鏡下觀察，拍照，200 倍鏡下計(jì)算平均數(shù)。

1.2.10 免疫共聚焦 將2×104個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，均勻接種在放置載玻片的24 孔板中，第2 天加野黃芩素（30 μmol/L）處理細(xì)胞，48 h 后，用多聚甲醛（4%）進(jìn)行10 min 固定，Triton X-100 孵育10 min 后將細(xì)胞膜穿透；用20%的山羊血清（PBST 配制），室溫封閉1 h；玻片放在濕盒中，滴加一抗工作液（ERK1/2）4℃孵育過夜，后滴加二抗工作液室溫孵育1 h，DAPI 孵育5 min，抗衰減熒光封片劑封片后在共聚焦顯微鏡（200 倍鏡）下采圖。

1.2.11 荷瘤實(shí)驗(yàn) 本研究在結(jié)腸癌細(xì)胞T84 中過表達(dá)了EGFR，并將15 只BALB/C 裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、野黃芩素組及野黃芩素+EGFR 過表達(dá)組，每組5 只裸鼠。取1×107處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T84 細(xì)胞及EFGR 穩(wěn)定過表達(dá)的T24 細(xì)胞，重懸于200 μL PBS，于BALB/C 裸鼠雙側(cè)腋下接種，待腫瘤大小為1 cm3左右且肉眼可見時(shí)，將野黃芩素組及野黃芩素+EGFR過表達(dá)組小鼠給予野黃芩素[20 mg/（kg·周）]灌胃，共2 次，對(duì)照組不作處理。后于細(xì)胞接種28 d 后殺死各組小鼠取腫瘤，檢測(cè)腫瘤的大小和質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用One-Way ANOVA 檢測(cè)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野黃芩素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著野黃芩素作用時(shí)間的延長(zhǎng)及藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率越來越高，且野黃芩素作用24、48 及72 h 的IC50值分別為78.5、36.7、和25.6 μmol/L（圖1A）?；诖搜芯浚诮酉聛淼膶?shí)驗(yàn)中筆者將野黃芩素組的使用濃度定為30 μmol/L，與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，兩組的作用時(shí)間定為48 h。通過Western Blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野黃芩素組較空白對(duì)照組的Bax、caspase3 及caspase9 的表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）（圖1B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比，野黃芩素處理后細(xì)胞的凋亡比例上升（P＜0.05）（圖1C）。

2.2 野黃芩素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的影響

通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，野黃芩素組可明顯降低結(jié)腸癌T84 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力（P＜0.05）（圖2）。

圖2 野黃芩素對(duì)結(jié)腸癌T84 細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的影響

2.3 野黃芩素對(duì)EGFR/ERK1/2 通路的影響

同對(duì)照組相比，野黃芩素組EGFR 和p-ERK1/2的蛋白水平均降低（P＜0.01）（圖3A），并促進(jìn)ERK1/2出核（圖3B），同時(shí)降低ERK1/2 通路下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc、c-fos 的表達(dá)（P＜0.01）（圖3C）。

圖3 野黃芩素對(duì)T84 細(xì)胞中EGFR/ERK1/2 通路的影響

2.4 野黃芩素對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及與EGFR/ERK/1/2 通路的相關(guān)性研究

轉(zhuǎn)染EGFR 的過表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)了EGFR 的表達(dá)（P＜0.05）（圖4A）。與野黃芩素組相比，野黃芩素+EGFR 過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力升高（P＜0.05）（圖4B），且體外成瘤能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）（圖4C），凋亡水平降低（P＜0.05）（圖4D）。

圖4 野黃芩素對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及與EGFR/ERK/1/2 通路的相關(guān)性

3 討論

野黃芩苷是半枝蓮的主要活性成分，可通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)以及促進(jìn)內(nèi)皮型-氧化氮合酶（endothelial-nitric oxide synthase，eNOS）表達(dá)來改善腦血管功能[10-11]；此外，其可通過降低Bcl-2/Bax 的比值[12]，提高天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease，caspase）的表達(dá)[13]，激活Fas及FasL 死亡受體蛋白的表達(dá)[14]促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤作用。野黃芩素是野黃芩苷的苷元和其體內(nèi)吸收的主要水合形式，其生物利用度為野黃芩苷的3 倍[15]。近年來，Cheng 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，野黃芩素可抑制肺癌A549 細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果提示，野黃芩素可明顯降低結(jié)腸癌T84 細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)其凋亡，并降低結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力，顯著抑制了體外腫瘤生成。此外，本研究結(jié)果還顯示，野黃芩素處理可降低EGFR、p-ERK1/2 的表達(dá)，提示野黃芩素可抑制EGFR/ERK1/2 通路的激活。EGFR 是分布于細(xì)胞表面的糖蛋白，可促進(jìn)ERK1/2 蛋白激活，并進(jìn)入細(xì)胞核在c-myc、c-fos 等轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)揮作用，進(jìn)而達(dá)到提高某些癌基因的高表達(dá)與異常轉(zhuǎn)錄的效果[17]。多項(xiàng)研究表明，EGFR 在多種腫瘤組織或細(xì)胞中被過度激活并通過激活其下游ERK1/2 信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[18-19]。Zhang 等[20]發(fā)現(xiàn)下調(diào)HOXA3 表達(dá)介導(dǎo)的EGFR/ERK 通路抑制可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的成瘤能力。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)野黃芩素可促進(jìn)ERK1/2 蛋白出核，并抑制其下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc、c-fos 的表達(dá)，進(jìn)一步表明野黃芩素可抑制EGFR/ERK1/2 通路的激活。此外，為了探究EGFR/ERK1/2 通路參與調(diào)控野黃芩素的抑癌機(jī)制，本研究在EGFR 過表達(dá)的基礎(chǔ)上給予細(xì)胞野黃芩素處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，凋亡受到抑制。小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)同樣也證明野黃芩素的抑癌作用在EGFR 過表達(dá)后受到顯著抑制。

綜上所述，野黃芩素可通過抑制EGFR/ERK1/2通路的激活抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，為野黃芩素應(yīng)用于結(jié)腸癌患者的臨床治療提供了理論依據(jù)。