胡 陽 宋莉萍 汪愛華* 梁紅艷 邱文兵 蔡美仲 崔曉培 高長斌 周國林 李 平*

（1 荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北荊州 434007；2 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430070）

普通白菜〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕為十字花科蕓薹屬白菜亞種一年生或二年生草本植物，俗稱小油菜、青菜。常規(guī)普通白菜的葉片和薹莖表皮覆有較厚的蠟質(zhì)，色澤多為綠色或暗綠色且無光澤，而亮綠普通白菜的葉片和薹莖表皮蠟質(zhì)極少、呈亮綠色有光澤。亮綠突變體的發(fā)現(xiàn)對于豐富普通白菜種質(zhì)資源和新品種選育具有十分重要的意義，研究其遺傳規(guī)律并定位突變基因可為普通白菜薹莖亮綠性狀在育種中的應(yīng)用和基因的克隆提供理論基礎(chǔ)。

植物表皮蠟質(zhì)可分為內(nèi)表皮蠟質(zhì)和外表皮蠟質(zhì)，內(nèi)表皮蠟質(zhì)填充于角質(zhì)層內(nèi)，外表皮蠟質(zhì)在角質(zhì)層外層組裝成不同形態(tài)的蠟質(zhì)晶體（包括片狀、絲狀、棒狀、管狀、顆粒狀等）（Eglinton & Hamilton，1967；Barthlott et al.，1998；Jenks et al.，2002；Jetter et al.，2006）。許多植物表皮均覆有一層蠟質(zhì)，其蠟質(zhì)組成和含量會因為物種及其器官的不同而有所變化，同一植物因生長時期、組織器官不同，其蠟質(zhì)成分和含量也有所差異（Post-Beittenmiller，1996；Jetter & Sch?ffer，2001）。植物表皮的蠟質(zhì)生物合成及運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，突變體材料由于蠟質(zhì)總量的減少或組分的改變而呈現(xiàn)亮綠有光澤的表型（Aarts et al.，1995）。Dellaert（1979）報道了第1 個擬南芥蠟質(zhì)突變體eceriferum（cer），此后在許多植物中均開展了蠟質(zhì)遺傳和基因方面的研究。對不同植物的蠟質(zhì)遺傳規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)缺失或減少的遺傳以單基因隱性遺傳為主（Anstey & Moore，1954；Tatlioglu，2006；Farnham，2010；Zhang et al.，2013a；Liu et al.，2017a），單基因顯性遺傳（Mo et al.，1992；Pu et al.，2013；Tang et al.，2015；Liu et al.，2017b）、不完全顯性遺傳（Priestley & Wills，1966）和雙基因隱性遺傳（周熙榮 等，1995；Zhang et al.，2013b）較少。對蠟質(zhì)合成及代謝相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中的CER1、CER2、CER3、CER4、CER6/CUT1、CER8、WAX2、WIN1等基因（Aarts et al.，1995；Hannoufa et al.，1996；Negruk et al.，1996；Xia et al.，1996；Fiebig et al.，2000；Hooker et al.，2002；Chen et al.，2003；Broun et al.，2004；Rowland et al.，2006；Lü et al.，2009；Bernard et al.，2012），水稻中的WSL1、WSL2、WSL3、WSL4、OsGL1-1等基因（Yu et al.，2008；Qin et al.，2011；Mao et al.，2012；甘露，2016），玉米中的GL1、GL2、GL8等基因（Xu et al.，1997；Velasco et al.，2002；Sturaro et al.，2005）參與編碼蠟質(zhì)合成或代謝相關(guān)的酶或蛋白質(zhì)。本試驗以2015 年3 月在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗基地發(fā)現(xiàn)的薹莖亮綠的普通白菜突變體自交系Q161 和常規(guī)有蠟質(zhì)自交系Q195 為親本，構(gòu)建6 世代群體，對普通白菜薹莖亮綠性狀遺傳規(guī)律進(jìn)行分析；利用BSA-seq 技術(shù)結(jié)合雙親的InDel 標(biāo)記開發(fā)，對控制薹莖亮綠性狀的基因進(jìn)行初定位研究，以期為普通白菜薹莖亮綠基因的克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017—2019 年在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗基地進(jìn)行。參試普通白菜自交系Q161 和Q195 均為武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所收集并經(jīng)多代自交選育獲得，其中Q161 薹莖亮綠、無明顯蠟質(zhì)，抽薹期早，薹莖較細(xì)，葉片較小，植株開展度較小，植株生長勢弱于有蠟質(zhì)材料；Q195薹莖有蠟質(zhì)、灰綠色，抽薹期晚，薹莖粗大，葉片較大，植株開展度較大。

1.2 試驗方法

1.2.1 6 世代群體構(gòu)建及表型鑒定 2017 年8 月底在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗田播種Q161（P1）和Q195（P2）種子，12 月底定植于大棚，2018 年3 月雜交獲得F1種子；5 月對雙親及F1種子進(jìn)行催芽，并利用4 ℃冰箱低溫春化15 d，春化完成后播種于加代溫室，待植株開花后利用F1自交并分別和雙親回交獲得F2、BC1P1、BC1P2群體；9 月將親本和各群體材料種子播于穴盤中，幼苗3～5 片真葉時定植于露地，2019 年3 月植株經(jīng)過低溫春化后抽薹，薹莖高度50 cm 左右時進(jìn)行表型鑒定，記錄各群體中有、無蠟質(zhì)植株數(shù)，采用Excel 軟件進(jìn)行卡方測驗。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和Qsep400TM分析采用CTAB 法（Murray & Thompson，1980）提取植株幼嫩葉片DNA，濃度稀釋到40～50 ng·μL-1備用。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，PCR Mix 8 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過Qsep400TM核酸蛋白分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.3 BSA-seq 分析 在F2群體中挑選24 株薹莖亮綠單株和24 株薹莖有蠟質(zhì)單株，分別提取DNA并通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性，采用Qubit 熒光計對DNA 濃度進(jìn)行精確定量，檢測合格的DNA 樣品備用。將稀釋后的24 株薹莖亮綠單株DNA 等量混合構(gòu)建混池1，24 株薹莖有蠟質(zhì)單株DNA 等量混合構(gòu)建混池2。同時提取雙親DNA，質(zhì)檢合格后備用。利用Illumina HiSeqTMPE150 對2 個子代池進(jìn)行基因組30×重測序，對2個親本進(jìn)行基因組20×重測序。參考基因組選擇白菜基因組Brapa_genome_v3.0（http：//brassicadb.org/brad/datasets/pub/Genomes/Brassica_rapa/V3.0/），大小為353 140 194 bp。將測序所得數(shù)據(jù)與白菜基因組進(jìn)行比對，分析測序深度及覆蓋度，數(shù)據(jù)質(zhì)量和比對均合格后用于后續(xù)分析。選擇親本重測序數(shù)據(jù)作為參考，分析2 個混池在親本間的SNP 和InDel頻率并預(yù)測候選區(qū)間。

1.2.4 InDel 標(biāo)記開發(fā) 利用普通白菜參考基因組作為“橋梁”，結(jié)合雙親的基因組重測序數(shù)據(jù)分析雙親之間的InDel 差異；根據(jù)親本的InDel 信息，提取InDel 上下游各100 bp 的序列，并根據(jù)上下游序列設(shè)計引物，引物的TM 值在55 ℃左右，長度18～22 bp。最后通過Blast 比對，篩選特異擴(kuò)增的多態(tài)性InDel 標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通白菜薹莖亮綠性狀的遺傳規(guī)律分析

2019年3月，在植株抽薹期對F1、F2、BC1P1、BC1P2群體進(jìn)行薹莖亮綠和有蠟質(zhì)性狀調(diào)查。其中，F(xiàn)1共4 株，薹莖均有蠟質(zhì)；F2共328株，薹莖有蠟質(zhì)植株256 株，薹莖亮綠植株72 株，分離比例為3.56∶1，經(jīng)卡方檢驗符合3∶1（χ2=1.47 ＜=3.84）；BC1P1共71 株，薹莖有蠟質(zhì)植株41株，薹莖亮綠植株30株，分離比例為1.37∶1，經(jīng)卡方檢驗符合1∶1（χ2=1.41 ＜=3.84）；BC1P2共72 株，薹莖均有蠟質(zhì)（表1）。推測普通白菜薹莖亮綠性狀由1 對隱性基因控制。

表1 普通白菜薹莖亮綠性狀的遺傳分析

2.2 BSA-seq 分析及候選區(qū)間預(yù)測

通過基因組重測序技術(shù)共產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)62.545 Gb，過濾后的有效數(shù)據(jù)為62.431 Gb，各樣本的原始數(shù)據(jù)量在12～20 Gb 之間，測序質(zhì)量高（Q20 ≥95.72%、Q30 ≥89.54%），GC 含量在38.59%～38.72%之間。4 個樣本的比對率在96.93%～97.71%之間，對參考基因組（排除N 區(qū)）的平均覆蓋深度在29.35×～47.74×之間，1×覆蓋度（至少有1 個堿基的覆蓋）在90.70%以上?；诨蚍中偷慕Y(jié)果，在2 個親本間共篩選出910 350 個多態(tài)性SNP 位點(diǎn)和243 311 個多態(tài)性InDel 位點(diǎn)。分析2 個混池的InDel 頻率差異分布，將A09 染色體的末端作為候選區(qū)間（圖1）。同時根據(jù)子代和親本的SNP 和InDel 頻率比較，結(jié)合ANNOVAR 注釋信息共篩選到101個候選SNP位點(diǎn)和56 個候選InDel 位點(diǎn)，位于A09 染色體的44.1～45.0 Mb 區(qū)間。

圖1 2 個混池的InDel 頻率差異在染色體上的分布

2.3 基因定位結(jié)果驗證

在A09 染色體的末端30～45 Mb 區(qū)間開發(fā)設(shè)計116 對InDel 引物，利用這116 對InDel 引物對親本和F2單株極端混池進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并通過Qsep400TM檢測篩選到特異性引物Br100、Br112、Br116（表2、圖2）。在F2群體中檢測發(fā)現(xiàn)這3 對引物擴(kuò)增片段的基因型和表型共分離（圖2）。利用這3 對引物對BC1P1的30 株薹莖亮綠單株和F2的72 株薹莖亮綠單株進(jìn)行檢測，在Br100 上篩選到20 個重組單株，在Br112 上篩選到4 個重組單株，在Br116 上篩選到1 個重組單株，Br100和Br112 在目的基因的同側(cè)（圖3）。在Br112 和Br116 染色體區(qū)段內(nèi)繼續(xù)設(shè)計合成18 對引物，通過對雙親和混池的PCR 擴(kuò)增篩選到3 對較好的特異性引物Br117、Br119、Br134（表2、圖4），利用這3 對引物對F2和BC1P1群體中的薹莖亮綠單株進(jìn)行檢測，在Br117 和Br119 上分別篩選到4 個重組單株和1 個重組單株（重組單株位于Br112 同側(cè)），Br134 未篩選到重組單株。綜上，初步將普通白菜薹莖亮綠基因定位在A09 染色體的標(biāo)記Br119和Br116 之間，2 個標(biāo)記間的物理距離為380 kb（圖3）。

圖2 引物Br100、Br112、Br116 在雙親、極端混池及F2 群體中的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 普通白菜薹莖亮綠性狀基因定位物理圖譜

圖4 引物Br117、Br119、Br134 在雙親、極端混池中的擴(kuò)增結(jié)果

表2 6 對InDel 特異性引物及其序列

3 結(jié)論與討論

十字花科蕓薹屬作物中白菜類、結(jié)球甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、青花菜等均有關(guān)于蠟質(zhì)研究的報道。其中在青花菜、普通白菜、青梗菜、紅菜薹中發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失性狀受1 對隱性基因控制（Anstey & Moore，1954；馮輝 等，2010；Zhang et al.，2013a；李紅蓮，2014）；在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失性狀受1 對顯性基因控制（Pu et al.，2013）；在結(jié)球甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)缺失性狀有隱性遺傳（劉東明 等，2014；Tang et al.，2015；Liu et al.，2017b），也有顯性遺傳（Liu et al.，2017a）。上述研究表明蕓薹屬不同作物和同種作物的不同材料之間蠟質(zhì)性狀遺傳有所差異。本試驗中，普通白菜自交系Q161 的薹莖亮綠蠟質(zhì)缺失性狀受1 對隱性基因控制，與曹陽等（2008）、Wang 等（2017）的研究結(jié)果一致。

本試驗在明確普通白菜薹莖亮綠性狀遺傳規(guī)律的基礎(chǔ)上，利用BSA-seq 分析預(yù)測候選區(qū)間，并開發(fā)InDel 標(biāo)記驗證候選區(qū)間，最終將薹莖亮綠基因定位在A09 染色體末端380 kb 的區(qū)間內(nèi)，與其最近的標(biāo)記分別為Br119 和Br116。根據(jù)白菜基因組注釋信息，定位區(qū)間內(nèi)有1 個與擬南芥蠟質(zhì)合成基因CER1同源的基因Bra032670（即BrCER1）。CER1基因主要在莖、花和果實的表皮中表達(dá)，CER1 蛋白包含鐵結(jié)合（富含組氨酸）結(jié)構(gòu)基元（Aarts et al.，1995），參與醛脫羧成烷烴的生物合成（Hannoufa et al.，1993）。Wang 等（2017）利用同源克隆方法克隆普通白菜的BrCER1基因，序列比對發(fā)現(xiàn)在無蠟質(zhì)突變體13S126 中Brcer1基因發(fā)生1 個39 bp 的缺失，引起mRNA 轉(zhuǎn)錄錯亂，進(jìn)而導(dǎo)致BrCER1基因的表達(dá)量在13S126 中下降。孫紅等（2017）通過RT-PCR 對大白菜蠟粉合成基因進(jìn)行分析，也初步證實了基因Bra032670與大白菜葉片表皮蠟粉合成有關(guān)。在結(jié)球甘藍(lán)中，控制無蠟質(zhì)性狀的Cgl1基因（CER1同源基因）在第1 個內(nèi)含子上有1 個2 722 bp 的插入，導(dǎo)致Cgl1起始密碼子發(fā)生移位（Liu et al.，2017a）。Pu 等（2013）在研究甘藍(lán)型油菜的無蠟質(zhì)基因BnA.GL時，將BnA.GL基因定位在9 號染色體末端，但對定位區(qū)間內(nèi)BnCER1基因（CER1同源基因）克隆時發(fā)現(xiàn)野生型和突變體材料之間該基因序列沒有明顯差異，僅在第5 個內(nèi)含子內(nèi)部有3 個SNP 的差異，基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在無蠟質(zhì)親本中BnCER1基因的表達(dá)量下降?？偨Y(jié)前人研究發(fā)現(xiàn)，CER1的同源基因是蕓薹屬作物中參與蠟質(zhì)合成的重要基因，但在不同作物中該基因變異位點(diǎn)差異很大，可能和物種基因進(jìn)化及突變有關(guān)。這些結(jié)果為研究蕓薹屬作物的蠟質(zhì)基因和功能分析代謝提供了一定的理論研究基礎(chǔ)，同時也為相關(guān)作物育種提供了應(yīng)用研究基礎(chǔ)。