華麗萍

（常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州 213161）

0 引言

百藥煎又名制百藥煎、百草煎，為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensis Mill.、青麩楊Rhus potanin Ⅱ Maxim.或紅麩楊Rhus pun-jabensis Stew.var.sinica (Diels) Rehd.et Wils.葉上的蟲癭,即五倍子，同茶葉、酒糟或酒曲等經(jīng)發(fā)酵制成的塊狀物[1]，主要成分為五倍子中可水解鞣質(zhì)水解后產(chǎn)生的沒食子酸[2-3]，具有清熱化痰，生津止渴等功效，臨床上可用于肺熱咳嗽，風(fēng)火牙痛，口舌糜爛，久痢脫肛等癥的治療[4]。目前百藥煎在《浙江省炮制規(guī)范（2015 年版）》《四川省炮制規(guī)范（2015年版）》等地方標(biāo)準(zhǔn)中有收載，但是各版本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查方法或檢查項(xiàng)均或多或少存在不合理之處，本研究通過對(duì)多批次百藥煎的性狀、鑒別、檢查（水分、總灰分、黃曲霉毒素）、沒食子酸含量測(cè)定、微生物限度等進(jìn)行研究，從而建立一種科學(xué)、合理的評(píng)價(jià)百藥煎質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)及方法。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100 高效液相色譜儀（VWD 檢測(cè)器，美國安捷倫科技有限公司）；1/10 萬電子分析天平（BP-211D 型，德國Sartorius）；Agilent 1260 液相色譜儀（FLD 檢測(cè)器，美國安捷倫科技有限公司），METTLER XS-205 電子天平；醫(yī)用超聲波清洗儀（KQ-1000E 型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

百藥煎（編號(hào)S1-18），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院劉輝主任鑒定為五倍子經(jīng)發(fā)酵而制成的干燥曲塊，詳見表1。

表1 百藥煎樣品信息

沒食子酸對(duì)照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-200803）；黃曲霉毒素混合對(duì)照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：610001-201703）；聚酰胺-6-薄膜（購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160906），五倍子對(duì)照藥材（購自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z20A9B68266）。

乙腈、甲醇為色譜醇，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

所收集的18 批樣品中S11、S17 為灰白色塊狀物。氣微，味酸、澀、微甘；S6、S14、S16 為棕褐色塊狀物。氣微，味酸、澀、微甘；其他批均為黑褐色塊狀物。氣微，味酸、澀、微甘。規(guī)定本品性狀為：灰白色至黑褐色塊狀物，氣微，味酸、澀、微甘。

2.2 鑒別

取本品粉末0.2g，加甲醇10mL，超聲處理15min（功率280W，頻率53kHz），濾過，濾液作為供試品溶液。另取五倍子對(duì)照藥材0.5g，加甲醇10mL，超聲15min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。再取沒食子酸對(duì)照品，加甲醇制成每1mL 含1mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

照薄層色譜法（《中國藥典》2015 版四部附錄0502）試驗(yàn)，吸取供試品1μL、對(duì)照藥材溶液，對(duì)照品溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以75%乙醇-冰醋酸（50:1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液顯色，日光下檢視。

2.3 檢查

2.3.1 水分

取供試品適量，照2015 版《中國藥典》四部通則0832 水分測(cè)定法（第二法）測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 18 批百藥煎水分、總灰分、黃曲霉毒素、沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果

18 批樣品中最高水分9.37%，最低水分6.67%，平均水分為8.01%，以平均值的120%設(shè)限，規(guī)定本品的水分應(yīng)不得過10.0%。

2.3.2 總灰分

取供試品適量，照2015 版《中國藥典》四部通則2302 灰分測(cè)定法（第一法，總灰分測(cè)定法）測(cè)定，結(jié)果見表2。

18 批樣品中最高總灰分3.12%，最低總灰分1.51%，平均總灰分為2.50%，以平均值的120%設(shè)限，規(guī)定本品的總灰分應(yīng)不得過3.0%。

2.3.3 黃曲霉毒素

照黃曲霉毒素測(cè)定法（《中國藥典》2015 年版四部通則2351 第一法）測(cè)定。

結(jié)果所測(cè)的18 批樣品均未檢出黃曲霉毒素，但由于本品為發(fā)酵類中藥飲片，且所檢測(cè)的樣本量有限，因此仍將黃曲霉毒素檢查列入百藥煎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 含量測(cè)定

百藥煎主要成分為五倍子可水解鞣質(zhì)水解后產(chǎn)生的沒食子酸，沒食子酸具有確切的抗炎、抑菌作用[5-7]，與百藥煎功效一致，因此通過測(cè)定沒食子酸的含量，可以有效的控制其質(zhì)量。

2.4.1 對(duì)照品貯備液的制備

取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL 含178.04μg 的對(duì)照品貯備液，備用。

2.4.2 供試品溶液的制備

取百藥煎粉末（過四號(hào)篩，170103）約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理20min（功率280W，頻率53kHz），放冷，再稱定重量，以提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1～50mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸（15:85）為流動(dòng)相；柱溫為30℃，檢測(cè)波長273nm，理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.4.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加50%甲醇分別稀釋1、2、5、10、25、50 倍，制成質(zhì)量濃度為4.45μg/mL、8.90μg/mL、17.80μg/mL、35.61μg/mL、89.02μg/mL、178.04μg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取各對(duì)照品溶液10μL，依法進(jìn)樣，記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，沒食子酸的線性回歸方程為Y=31.367，X=10.019，R2=1，表明沒食子酸在此濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液（35.61μg/mL）10μL 注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，沒食子酸峰面積的RSD 為0.32%。表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液及對(duì)照品溶液10μL，于0、2、4、8、12、24h 時(shí)分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量10μL，測(cè)定，計(jì)算。對(duì)照品溶液中沒食子酸24h 內(nèi)峰面積的RSD 為0.60%、樣品溶液中沒食子酸24h 內(nèi)峰面積的RSD 為1.29%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取百藥煎粉末（過四號(hào)篩，170103）約0.1g，共6 份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果，沒食子酸平均含量為45.12%，RSD 為0.58%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的百藥煎粉末（過四號(hào)篩，170103）約50mg，共6 份，精密加入相應(yīng)量對(duì)照品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4.9 含量測(cè)定

取百藥煎樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算，沒食子酸含量（按干燥品計(jì)算）測(cè)定結(jié)果見表2。

測(cè)定的18 批百藥煎中沒食子酸含量為12.01%～52.83%，平均含量為39.89%，取平均值的80%設(shè)限，規(guī)定百藥煎中沒食子酸含量應(yīng)不低于30.0%。

2.5 微生物限度

照微生物限度檢查法（《中國藥典》2015 版四部附錄1106）檢查，不得檢出沙門菌（10g），耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于104cfu（1g）。

18 批百藥煎樣品中未檢出沙門菌，耐膽鹽革蘭陰性菌檢查符合規(guī)定。

3 討論

性狀研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用米酒曲發(fā)酵后所得百藥煎飲片顏色較白酒曲淺，同種酒曲發(fā)酵后切片干燥者較粉碎后壓片的飲片顏色深，而飲片顏色與其他指標(biāo)之間無相關(guān)性，因此將本品性狀描述為：灰白色至黑褐色塊狀物。由于所檢查的各批次百藥煎樣品總灰分均小于5.0%且本品非根類藥材及制品，因此不進(jìn)行酸不溶性灰分檢查[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》及部分文獻(xiàn)研究中百藥煎沒食子酸含量測(cè)定方法參考藥典的水解法進(jìn)行測(cè)定，即加4mol/L 的鹽酸水浴3.5h 后測(cè)定[10-13]。而采用水解法測(cè)定則極不科學(xué)，該法不能區(qū)分其是否經(jīng)歷了發(fā)酵過程。在沒食子酸含量測(cè)定方法研究過程中我們對(duì)樣品處理方法進(jìn)行了詳細(xì)研究，主要對(duì)提取溶劑、溶劑體積、提取次數(shù)、提取時(shí)間等進(jìn)行考察后最終確定了百藥煎含量測(cè)定供試品處理方法[14-15]。

本標(biāo)準(zhǔn)研究過程收集了不同廠家、不同批號(hào)共計(jì)18 批百藥煎樣品，此外我們還制備了6 批以進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明制訂的標(biāo)準(zhǔn)合理、可行，專屬性強(qiáng)，可為百藥煎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。