吳飛揚(yáng) 仝理 吳立斌 何雨霞 儲(chǔ)浩然

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

腸易激綜合癥(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是與正常腸蠕動(dòng)改變相關(guān)的功能性胃腸疾病。IBS的臨床癥狀包括腹痛或不適，大便不規(guī)則、腹脹和其它合并癥[1]。IBS在臨床有多種亞型，腹瀉型在臨床上較為多見，嚴(yán)重影響患者的工作家庭，降低患者的生活質(zhì)量[2-3]。在亞洲，歐洲和美國(guó)進(jìn)行了許多針灸研究，使用艾灸的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)相對(duì)較少[4]。我們課題組通過(guò)長(zhǎng)期、系統(tǒng)地對(duì)艾灸治療IBS-D 的臨床觀察，認(rèn)為艾灸對(duì)其有獨(dú)特的療效，能顯著改善患者的癥狀、體征，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明艾灸上巨虛、天樞可降低IBS-D模型大鼠血清炎癥因子和改善大鼠的腸功能紊亂狀態(tài)[5-6]。NO與IBS發(fā)病有密切相關(guān)性，可影響結(jié)腸初級(jí)傳入神經(jīng)興奮性增加導(dǎo)致疼痛和內(nèi)臟超敏反應(yīng)[7-8]。本研究通過(guò)分析大鼠結(jié)腸組織中的NO水平、內(nèi)臟敏感性，探索艾灸治療IBS-D的機(jī)制。

1 材料

1.1試驗(yàn)對(duì)象 SD雄性6月齡大鼠30只(220.18±14.089 g)，許可證號(hào)：sexk(皖)2017-001，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。對(duì)SD大鼠所使用的各種處理方法均遵照動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。按隨機(jī)數(shù)表方法，隨機(jī)分為空白組、模型組、艾灸組，每組10只。

1.2儀器和藥品 細(xì)艾條(批號(hào)：20181006、廠家：南陽(yáng)宛北艾絨廠)，番瀉葉(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑提供)，一氧化氮檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0021 & 052218190219，廠家：碧云天生物技術(shù))，細(xì)胞與組織裂解液(批號(hào)：S3090 & 081618190122，廠家：碧云天生物技術(shù))，酶標(biāo)儀(型號(hào)：RT-6000，廠家：雷杜)，漩渦混合器(型號(hào)：GL-88B，廠家：其林貝爾儀器制造公司)，離心機(jī)(型號(hào)：JW3021HR，廠家：安徽嘉文)，電熱恒溫箱(型號(hào)：DNP-9052BS-Ⅲ、廠家：上海三發(fā))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1造模 IBS-D大鼠模型采用精神心理應(yīng)激法加化學(xué)刺激法，本實(shí)驗(yàn)中采用比較簡(jiǎn)單易行的束縛應(yīng)激作為精神心理應(yīng)激，化學(xué)刺激物選用具有中醫(yī)特色的番瀉葉制劑。將模型組和艾灸組大鼠稱重記錄，按照每100 g體質(zhì)量1 mL換算灌胃量。將冰箱中的番瀉葉制劑取出復(fù)溫至室溫，用注射器抽取適宜灌胃量濃度為0.45 g/mL番瀉葉制劑進(jìn)行灌胃。待所有大鼠灌胃完畢，用粗制棉繩束縛大鼠雙后肢，限制其活動(dòng)，放入標(biāo)記序號(hào)的飼養(yǎng)箱中，記錄開始束縛時(shí)間并用鬧鐘定時(shí)1 h，1 h后解開束縛放回普通飼養(yǎng)箱。連續(xù)14天后行稀便率和內(nèi)臟敏感性測(cè)試，達(dá)到IBS-D臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。

2.2空白組處理 將空白組大鼠稱重記錄，按照每100 g體重1 mL換算灌胃量，用注射器抽取適宜灌胃量蒸餾水進(jìn)行灌胃，不予以束縛，連續(xù)14天行稀便率和內(nèi)臟敏感性測(cè)試。

2.3艾灸治療 艾灸組大鼠取雙側(cè)上巨虛、天樞(參照林文注《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠穴位的定位)。將艾灸組大鼠置于特制大鼠艾灸架限制其活動(dòng)，采用直徑0.5 cm細(xì)艾條，點(diǎn)燃后懸于穴位上，燃燒點(diǎn)距離穴位2 cm～3 cm，每天1次，每次每穴灸30 min，每日一次，連續(xù)7 d。

2.4觀察指標(biāo)與檢測(cè)

2.4.1稀便率的計(jì)算 在造模和治療后一天，將各組大鼠單籠飼養(yǎng)?；\下放置濾紙，濾紙有污跡計(jì)為稀便，等待6 h，計(jì)算稀便率。(R=L/A×100%，R稀便率，L稀便數(shù)、A總便數(shù))。

2.4.2內(nèi)臟敏感性評(píng)估 采用結(jié)直腸球囊擴(kuò)張反射測(cè)定腸內(nèi)臟敏感性。在兩次稀便率試驗(yàn)結(jié)束后實(shí)驗(yàn)大鼠禁食不禁水12 h，適量七氟烷中輕度麻醉大鼠，將大鼠固定于大號(hào)透明實(shí)驗(yàn)鼠固定器上，經(jīng)肛門將潤(rùn)滑后的8F導(dǎo)尿管插入腸內(nèi)，球囊末端距肛門約為1 cm，用膠帶將導(dǎo)尿管在大鼠尾根部固定在合適位置。大鼠清醒后，待其適應(yīng)，用注射器將26～28℃生理鹽水注入球囊內(nèi)，腹壁收縮反射被觀察到時(shí)，記下使大鼠腹壁收縮反射的最小容量閾值?；謴?fù)20 min后再次進(jìn)行測(cè)試，記錄3次測(cè)試值得出平均值，為該大鼠的最小容量閾值。

2.4.3測(cè)定NO含量 第二次內(nèi)臟敏感性評(píng)估進(jìn)行結(jié)束后，經(jīng)腹腔注射10%的水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，打開腹腔找到腸組織，在肛門到近端的結(jié)腸中取1cm結(jié)腸，剪開結(jié)腸，在裝有生理鹽水的瓶中清洗干凈后，把結(jié)腸組織剪切成細(xì)小的碎片。 按照每20毫克組織加入100～200微升裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿。充分裂解后，10000～14000 g離心3-5 min，取上清液0.9% NaCl稀釋備用。取出Griess Reagent I和II，使回復(fù)室溫。0.9% NaCl稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。按50 μl/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及結(jié)腸組織上清液。按50 μL/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent I。按50μL /孔，各孔中加入室溫Griess Reagent II。酶標(biāo)儀540 nm 測(cè)定吸光度。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組與組之間的差異采用方差分析比較，若方差齊，用LSD法分析，若方差不齊，則使用Tamhan’s法分析；配對(duì)樣本t檢驗(yàn)用于干預(yù)前后比較。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)設(shè)為p<0.05。相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)系數(shù)，若兩組均服從正態(tài)分布，則使用雙變量相關(guān)分析中的Pearson相關(guān)分析;若兩組不全部服從正態(tài)分布，則使用Spearman相關(guān)分析。若p<0.05,為兩個(gè)變量存在相關(guān)性，若相關(guān)系數(shù)為。0

表 1 各組稀便率、最小容量閾值和腸組織NO的比較(x±s, n=10)

3 結(jié)果

3.1三組大鼠腸組織NO水平、稀便率、內(nèi)臟敏感性 艾灸組和模型組在造模后稀便率均高于空白組(p<0.05)。艾灸組稀便率在治療后低于模型組(p<0.05)。大鼠腹壁收縮反射的最小容量閾值在模型組和未干預(yù)的溫和艾灸組均低于正常組(p<0.05)；溫和灸干預(yù)之后，大鼠腹壁收縮反射的最小容量痛閾值相較于模型組均偏高(p<0.05)。三組大鼠腸組織NO水平具有可比性(p<0.05)。與空白組比較，模型組和艾灸組大鼠腸組織NO水平升高(p<0.05)；與模型組比較，艾灸組大鼠腸組織NO降低(p<0.05)。

3.2三組大鼠腸組織NO水平與稀便率、內(nèi)臟敏感性相關(guān)性分析 根據(jù)散點(diǎn)圖判斷大鼠結(jié)腸組織NO水平與稀便率、內(nèi)臟敏感性之間存在線性關(guān)系，分析表明NO水平與稀便率呈正相關(guān)(0

圖1注：與稀便率相關(guān)性r1=0.932, p<0.05 圖2注：與最小容量閾值r2=-0.620，p<0.05

4 討論

腹瀉型腸易激綜合征屬中醫(yī)“泄瀉”范疇，針灸治療常涉及到的經(jīng)脈以足陽(yáng)明胃經(jīng)、足太陽(yáng)膀胱經(jīng)和任脈,特定穴以募穴、下合穴、背俞穴、五輸穴。天樞穴氣血強(qiáng)盛，氣血物質(zhì)與大腸經(jīng)特性相符，向外傳輸是輸入大腸經(jīng)所在的天部層次，為大腸經(jīng)氣血的主要來(lái)源之處，對(duì)于大腸生理功能具有雙向調(diào)節(jié)作用?！秲?nèi)經(jīng)》曰“合治內(nèi)腑”，上巨虛為大腸下合穴，多用于腸胃功能失調(diào)性疾病，對(duì)功能性腸病具有調(diào)節(jié)作用[11]。儲(chǔ)浩然主任[12]通過(guò)臨床與實(shí)驗(yàn)室研究反復(fù)驗(yàn)證了艾灸以及針刺天樞、上巨虛穴對(duì)IBS-D治療的有效性。張艷佶等[13]基于數(shù)據(jù)挖掘的針灸治療腹瀉型腸易激綜合征的取穴規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)腧穴使用頻次最高的為天樞、足三里、上巨虛。大腸為傳導(dǎo)之官，其功能失常而為泄瀉，故治療取大腸之下合穴上巨虛、募穴天樞為主穴，起到調(diào)理腸胃氣機(jī)、泌別清濁的作用。艾灸作為一種有效的IBS-D治療方法。熱刺激，光輻射和艾煙的組合對(duì)改善IBS-D模型大鼠的內(nèi)臟疼痛和水代謝具有最佳效果。其中，熱刺激和光輻射可能起主要作用[14]。臨床艾灸場(chǎng)所內(nèi)有害物質(zhì)濃度遠(yuǎn)低于各毒理試驗(yàn)中艾煙可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良效應(yīng)的濃度。在臨床應(yīng)用中可有效保證艾灸療法的安全性[15]。此外艾灸治療方式溫和、操作簡(jiǎn)便，治療時(shí)患者感到溫?zé)崾孢m，為大多數(shù)患者所接受。

相關(guān)研究表明IBS患者的結(jié)腸組織NO水平顯著高于健康對(duì)照組，與一氧化氮合成酶基因有關(guān)，該基因激活可促進(jìn)NO產(chǎn)生，有助于抗微生物和抗病原活性。通過(guò)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶( Induced nitric oxide synthase, iNOS)的上調(diào)產(chǎn)生的NO包含多種作用，其利弊取決于產(chǎn)生的數(shù)量，持續(xù)時(shí)間和解剖部位。在炎癥性腸病中，iNOS介導(dǎo)的NO產(chǎn)生成為免疫反應(yīng)失調(diào)的一部分，從而導(dǎo)致慢性炎癥性疾病。腸上皮細(xì)胞中NO的產(chǎn)生增加與腸道炎癥的發(fā)生和維持密切相關(guān)[16-17]。神經(jīng)源性一氧化氮合成酶(Neurogenic nitric oxide synthase, nNOS)是應(yīng)激狀態(tài)下Cajal間質(zhì)細(xì)胞的生物標(biāo)志物，活化的nNOS會(huì)在肌間神經(jīng)叢中合成NO，并通過(guò)平滑肌松弛在蠕動(dòng)和結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間中發(fā)揮重要作用。IBS-D大鼠腸運(yùn)動(dòng)活躍促進(jìn)糞便運(yùn)動(dòng)，從而縮短了結(jié)腸中水的吸收時(shí)間,從而導(dǎo)致了IBS-D大鼠大便含水量的增加[18]。內(nèi)臟超敏反應(yīng)與周圍感覺神經(jīng)元中瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道(transient receptor potential vanilloid,TRPV)的上調(diào)和敏化有關(guān)。表達(dá)TRPV的感覺神經(jīng)元在整個(gè)肌小節(jié)的消化道中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被辣椒素，熱，酸和炎性介質(zhì)激活時(shí)，會(huì)產(chǎn)生疼痛或燒灼感。TRPV4激動(dòng)劑特異性激活陽(yáng)離子電流和鈣流入，劑量依賴性引起內(nèi)臟高敏感。在內(nèi)臟高敏感中起關(guān)鍵作用[19]。NO 是道香草素受體4 (Transient receptor potential vanilloid, TRPV4)，瞬時(shí)感受器電位離子通調(diào)控的下游信號(hào)分子。TRPV4受體的激活，導(dǎo)致具有鈣離子依賴性的一氧化氮合成酶促進(jìn)L-精氨酸合成NO。被合成的NO是參與介導(dǎo)傷害性疼痛信號(hào)傳遞中的重要介質(zhì)，它既能通過(guò)cGMP-PKG通路促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)-谷氨酸的釋放，又能通過(guò)此通路減緩抑制性神經(jīng)遞質(zhì)-氨基丁酸電流[20-21]。本研究也證實(shí)NO與內(nèi)臟敏感性具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

艾灸天樞和上巨虛通過(guò)降低IBS-D大鼠結(jié)腸組織中NO水平,降低大鼠稀便率，提高大鼠腹壁收縮反射的最小容量閾值，改善IBS-D大鼠的腸道運(yùn)動(dòng)和降低腸道敏感性，從而改善IBS-D的腹瀉癥狀。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證艾灸治療腸易激綜合征的有效性為臨床治療提供了一定的理論依據(jù)，也證明了艾灸治療腸易激綜合征與NO的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究艾灸治療與NO相關(guān)通路提供一定的理論依據(jù)。