胡榮庭，陳朝暉，王婷婷

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)1.研究生院，2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院（康復(fù)醫(yī)學(xué)院），安徽 合肥， 230038）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)橹饕卣鞯穆酝诵行怨顷P(guān)節(jié)疾病，疼痛、腫脹和功能障礙是其典型表現(xiàn)。臨床研究指出［1］，OA 患者均存在不同程度的本體感覺減退，與疼痛、關(guān)節(jié)功能均存在正相關(guān)性。本體感覺較差的患者表現(xiàn)出更低程度的姿勢(shì)控制和平衡穩(wěn)定性，以及更高程度的關(guān)節(jié)功能活動(dòng)受限［2，3］。以此為依 據(jù)，部分研究者對(duì)OA 患者進(jìn)行本體感覺康復(fù)訓(xùn)練，患者的肌力、疼痛以及穩(wěn)定 性 均 有 效 改 善，關(guān) 節(jié) 功 能 活 動(dòng) 能 力 提 高［4，5］。本體感覺與OA 的聯(lián)系已經(jīng)得到廣大學(xué)者的認(rèn)同，其臨床效果也已得到驗(yàn)證，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面多以破壞膝關(guān)節(jié)本體感受器的重要載體-前交叉韌帶，探討本體感覺與膝關(guān)節(jié)功能活動(dòng)、骨關(guān)節(jié)炎之間的聯(lián)系。但是前交叉韌帶本身就是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，通過損傷前交叉韌帶觀察本體感受器以及關(guān)節(jié)軟骨的病理改變有失偏頗，無法明確本體感覺在其中發(fā)揮的作用。因此，本研究在切斷兔脊神經(jīng)后根保留其運(yùn)動(dòng)能力的基礎(chǔ)上復(fù)制本體感覺障礙動(dòng)物模型，以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)變化、關(guān)節(jié)軟骨病理改變、本體感受器的變化以及電生理的檢測(cè)，探討感覺缺失對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的影響，為OA 的發(fā)病機(jī)制以及臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

由安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供成年健康SPF 級(jí)新西蘭大白兔20 只，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，體重2.0～2.5 kg。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南，并通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：AHUCMrabbits-2019010）。根據(jù)隨機(jī)化原則將動(dòng)物進(jìn)行分組：對(duì)照組9 只，模型組11 只。

1.2 造模

采用脊神經(jīng)后根切斷法進(jìn)行模型的制作［6，7］：術(shù)前禁食12 h。3%戊巴比妥鈉（3.0 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，兔俯臥位固定，手術(shù)范圍內(nèi)備皮，常規(guī)消毒，于兔右后背肋骨下第三、四節(jié)棘突旁1 cm 做一縱型切口，打開皮膚、皮下筋膜顯露棘突后，鈍性分離棘旁肌肉，暴露L5-L6上下關(guān)節(jié)突及橫突，使用玻璃分針從椎間孔進(jìn)入離斷L5-L6脊神經(jīng)后根。最后止血、生理鹽水沖洗、逐層縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d 肌注青霉素20 萬U/d，并用0.5%碘伏每日消毒，積極預(yù)防感染。常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑和設(shè)備

蘇木素、伊紅染色液（貨號(hào)BA4041、BA4022，Baso）；Bielschowsky 神經(jīng)染色（貨號(hào)G2306，Solarbio）；tunel 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C1098，Beyotime）；蛋白酶K（貨號(hào)ST533，Beyotime）；石蠟切片機(jī)（型號(hào)Shandon Finesse325，Therom）；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)Nikon eclipse 50i，Nikon）。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)兔行為學(xué)評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即術(shù)后第8 周觀察兔的運(yùn)動(dòng)情況，兔后肢運(yùn)動(dòng)功能依據(jù)改良的Tarlov 分級(jí)法［8］進(jìn)行評(píng)價(jià)。正常情況下兔后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分為5 分。

1.4.2 電生理檢測(cè)［9］采用乙醚吸入+1% 利多卡因?qū)ν眠M(jìn)行局部麻醉，固定其頭部及四肢，從髕內(nèi)側(cè)進(jìn)入關(guān)節(jié)腔暴露前交叉韌帶。體感誘發(fā)電位（SEPs）的檢測(cè)是將記錄電極點(diǎn)放置在兔頭正中矢狀線與兩眶后緣的連線交點(diǎn)旁開0.2 cm，再往后移0.5 cm 處。皮層參考電極放置鼻根部皮下，下肢近端放置皮下電極接地，檢測(cè)開始后記錄潛伏期和波峰。EMG 的檢測(cè)是在上述操作完成后將記錄電極放置于腘繩肌肌腹內(nèi)，參考電極放置于內(nèi)踝。雙極表面電極于前交叉韌帶股骨端和脛骨端進(jìn)行電刺激，強(qiáng)度為18～20 V。

1.4.3 關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin's 評(píng)分 電生理檢測(cè)結(jié)束后將完整取下的膝關(guān)節(jié)置于10% 福爾馬林溶液中固定。48 h 后再經(jīng)過以下步驟：脫鈣、二次取材（僅取股骨內(nèi)側(cè)髁部分軟骨組織）、脫水、包埋、制作成蠟塊，切片后行HE染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨組織的軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨基質(zhì)染色、軟骨潮線、軟骨結(jié)構(gòu)情況，拍照留存，并對(duì)軟骨組織行Mankin′s 評(píng)分。

1.4.4 Bielschowsky 神經(jīng)染色［10］取右膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶，經(jīng)氨銀溶液、海波溶液、氯化金溶液等溶液浸泡后制成蠟塊，切成厚度為10 μm 的切片后使用光學(xué)顯微鏡觀察，鏡下神經(jīng)元、軸突、神經(jīng)纖維為黑色。需要注意的是石蠟切片需標(biāo)記股骨端、中間部和脛骨端，計(jì)數(shù)本體感受器數(shù)量。

1.4.5 TUNEL 軟骨細(xì)胞凋亡測(cè)定 取HE 染色時(shí)制備的蠟塊繼續(xù)切片，厚度為3 μm，經(jīng)脫蠟、脫水透明后嚴(yán)格按照TUNEL 試劑盒上的步驟，依次加入蛋白酶K、過氧化物酶、TUNEL 反應(yīng)液、HRP、DAB 顯色液、蘇木素等溶液，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞調(diào)往情況并攝片留存。凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）［11］：每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)含有細(xì)胞凋亡數(shù)相對(duì)最多的高倍視野（×400），計(jì)算100 個(gè)軟骨細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 23.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析和處理，計(jì)量資料均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。樣本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足獨(dú)立、正態(tài)、方差齊性使用t檢驗(yàn)，不滿足條件時(shí)則使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以P＜0.05或P＜0.01 表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兔行為學(xué)改變

模型組兔術(shù)后第2 天，右后肢不能正?；顒?dòng)，不能協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，呈被動(dòng)拖動(dòng)、癱瘓狀態(tài)。隨著實(shí)驗(yàn)過程的進(jìn)展至術(shù)后8 周，兔運(yùn)動(dòng)功能基本正常，但有2只兔運(yùn)動(dòng)功能僅達(dá)到3 級(jí)，考慮是否與手術(shù)創(chuàng)傷、損傷脊神經(jīng)前根有關(guān)。對(duì)照組術(shù)后功能活動(dòng)正常。見表1。

表1 兩組兔改良Tarlov 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)比較（分，±s）Tab 1 Comparison of modified Tarlov scoring standard between the two groups（points，±s）

表1 兩組兔改良Tarlov 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)比較（分，±s）Tab 1 Comparison of modified Tarlov scoring standard between the two groups（points，±s）

組別對(duì)照組模型組n 9 1 1 t P Tarlov 評(píng)分5.00±0.00 4.54±0.82 1.838 0.096

2.2 SEPs 和EMG 潛伏期及波幅變化

與對(duì)照組相比，模型組SEPs 和EMG 的潛伏期延長(zhǎng)，波幅下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組SEPs 和EMG 潛伏期及波幅變化（±s）Tab 2 Latency and amplitude changes of SEPs and EMG in two groups（±s）

表2 兩組SEPs 和EMG 潛伏期及波幅變化（±s）Tab 2 Latency and amplitude changes of SEPs and EMG in two groups（±s）

組別n 9 1 1 SEP潛伏期（ms）13.89±2.61 18.64±3.17*-3.594 0.002對(duì)照組模型組t P波幅（μV）20.89±2.20 13.09±3.21 6.181 0.000 EMG潛伏期（ms）5.78±1.99 12.09±3.05-5.341 0.000波幅（μV）0.43±0.39 0.13±0.21 2.228 0.039

2.3 兔組織形態(tài)學(xué)觀察及Mankin's 評(píng)分

光鏡下觀察，對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，層次結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞分布均勻，呈柱狀排列，形態(tài)正常，未見簇集；模型組關(guān)節(jié)軟骨表面消失，層次結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨基質(zhì)著色不均，軟骨細(xì)胞分布不均，數(shù)量減少，偶見簇集。與對(duì)照組相比，模型組關(guān)節(jié)軟骨損傷更為嚴(yán)重（P＜0.01）。見圖1、表3。

表3 兩組兔Mankin’s 評(píng)分比較（分，±s）Tab 3 Comparison of Mankin's score between the two groups（points，±s）

表3 兩組兔Mankin’s 評(píng)分比較（分，±s）Tab 3 Comparison of Mankin's score between the two groups（points，±s）

組別對(duì)照組模型組n 9 1 1 t P Mankin's 評(píng)分0.33±0.50 3.72±0.79-11.200 0.000

圖1 兩組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察（HE，400×）Fig 1 Morphological observation of two groups of articular cartilage tissues（HE，400×）

2.4 兔本體感受器及數(shù)量變化

對(duì)照組韌帶中本體感受器數(shù)量無明顯變化，神經(jīng)元形態(tài)基本正常，分布均勻，韌帶組織結(jié)構(gòu)致密；模型組本體感受器數(shù)量明顯減少，形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則改變，韌帶組織結(jié)構(gòu)松散發(fā)生固縮。與對(duì)照組比較，模型組本體感受器數(shù)量明顯減少差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、表4。

表4 兩組兔本體感受器計(jì)數(shù)比較（個(gè)，±s）Tab 4 Comparison of the number of proprioception between the two groups（PCs.，±s）

表4 兩組兔本體感受器計(jì)數(shù)比較（個(gè)，±s）Tab 4 Comparison of the number of proprioception between the two groups（PCs.，±s）

組別對(duì)照組模型組n91 1 tP本體感受器26.11±3.22 10.36±2.80 11.699 0.000

圖2 本體感受器Bielschowsky 神經(jīng)染色結(jié)果（400×）Fig 2 Proprioceptor Bielschowsky nerve staining results（400 ×）

2.5 TUNEL 及軟骨細(xì)胞凋亡率

TUNEL 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于對(duì)照組，關(guān)節(jié)軟骨損傷嚴(yán)重，也說明本體感覺障礙對(duì)膝骨關(guān)節(jié)的發(fā)生、發(fā)展均有影響（P＜0.01）。見圖3、表5。

表5 兩組兔軟骨細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）Tab 5 Comparison of chondrocyte apoptosis rate between two groups（%，±s）

表5 兩組兔軟骨細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）Tab 5 Comparison of chondrocyte apoptosis rate between two groups（%，±s）

組別對(duì)照組模型組n91 1 tP凋亡率9.20±1.30 52.00±4.24-21.562 0.000

圖3 軟骨細(xì)胞凋亡TUNEL 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（400×）Fig 3 TUNEL test results of chondrocyte apoptosis（400×）

3 討論

本體感覺是感知關(guān)節(jié)位置與運(yùn)動(dòng)，維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的重要因素。膝關(guān)節(jié)的本體感覺主要通過膝周的韌帶、肌肉、半月板等組織接收運(yùn)動(dòng)覺、位置覺等信息，經(jīng)傳入神經(jīng)傳遞至不同中樞系統(tǒng)，綜合分析整合后，再通過調(diào)節(jié)Y 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元將信號(hào)傳至效應(yīng)器，進(jìn)而支配膝關(guān)節(jié)肌纖維，調(diào)節(jié)其肌張力，維持膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)和穩(wěn)定性［12，13］。本實(shí)驗(yàn)為了探究本體感覺缺失與關(guān)節(jié)軟骨退變之間最直接的聯(lián)系，采用了脊神經(jīng)后根切斷法，主要有兩方面原因。其一，脊神經(jīng)根包括以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維為主的前根和以感覺神經(jīng)纖維為主的后根，切斷后根可以在保留動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的基礎(chǔ)上破壞其感覺功能，阻隔“感覺信號(hào)”的傳輸，直觀展示本體感覺障礙對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的影響。L5-L7是兔股神經(jīng)干軀體傳出和傳入的主要節(jié)段，其中L5-L6是股神經(jīng)干軀體傳出的優(yōu)勢(shì)節(jié)段［7］。模型組通過離斷L5-L6脊神經(jīng)后根，破壞完整的本體感覺傳導(dǎo)通路，改變了肌肉張力和協(xié)同，造成膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性下降以及應(yīng)力失衡，最終造成關(guān)節(jié)軟骨破壞的結(jié)果。其二，改良Hult 法是OA 的經(jīng)典造模方法，主要通過離斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)切半月板等結(jié)構(gòu)，造成下肢應(yīng)力失衡，加速軟骨退行性改變。但此種造模方法為有創(chuàng)性損傷，無法保留完整的前交叉韌帶，不僅會(huì)引發(fā)出血、滑膜炎癥等，而且損傷了膝周的效應(yīng)器，嚴(yán)重影響本體感覺對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的研究。

本體感受器是人體接收外在刺激的重要裝置。相較于膝關(guān)節(jié)其他組織，前交叉韌帶含有更豐富的本體感受器，可以感受關(guān)節(jié)、肌肉的應(yīng)力和拉力，參與 膝 關(guān) 節(jié) 的 運(yùn) 動(dòng) 和 穩(wěn) 定 性 控 制［14，15］。有 研 究 證實(shí)［16，17］，患者ACL 損傷后，隨著時(shí)間推移機(jī)械感受器數(shù)量逐漸減少，只殘留少量游離神經(jīng)末梢，膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定感明顯，本體感覺基本消失。本體感受器數(shù)量減少，傳入中樞系統(tǒng)的本體感覺信息缺失，會(huì)造成中樞系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)肌肉的控制能力減弱，關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和穩(wěn)定性下降，進(jìn)而可能改變下肢生物力學(xué)模式，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者［18］針對(duì)OA 患者進(jìn)行本體感覺強(qiáng)化訓(xùn)練，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者關(guān)節(jié)平衡能力和穩(wěn)定性提高，骨關(guān)節(jié)炎癥狀得到緩解。這也間接證實(shí)了本體感覺障礙在OA 的形成與發(fā)展中扮演著重要的角色。本實(shí)驗(yàn)通過使用Bielschowsky 神經(jīng)染色法觀察本體感覺傳導(dǎo)通路切斷后本體感受器的變化，對(duì)照組韌帶中本體感受器數(shù)量、形態(tài)無明顯變化，分布均勻，結(jié)構(gòu)完整，韌帶組織結(jié)構(gòu)緊密，而模型組韌帶本體感受器數(shù)量明顯減少，形態(tài)存在不規(guī)則改變，不規(guī)則的稀疏分布，韌帶組織結(jié)構(gòu)松散，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

目前SEPs 和EMG 是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本體感覺公認(rèn)的有效設(shè)備［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，SEP 的變化主要反應(yīng)本體感覺傳導(dǎo)通路的完整性和功能狀態(tài)，而EMG 的變化主要反應(yīng)相關(guān)肌群（腘繩?。┓瓷湫允湛s的能力。檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物SEPs 和EMG 的潛伏期延長(zhǎng)，波幅降低，說明本體感覺傳導(dǎo)通路的功能活動(dòng)受限，無法正常參與膝關(guān)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)相關(guān)肌群神經(jīng)肌肉控制能力減弱，可能導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)感明顯，加重關(guān)節(jié)軟骨損傷。這也從側(cè)面說明，本體感覺障礙可能造成骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。OA 發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，其主要由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)構(gòu)成，其中軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞類型，具有分泌和維持軟骨基質(zhì)，調(diào)節(jié)軟骨代謝的功能［19］。軟骨細(xì)胞始終存在一定比例的凋亡現(xiàn)象，有利于保證軟骨的正常結(jié)構(gòu)和功能。但是軟骨細(xì)胞過度凋亡，超過其增殖數(shù)目，則會(huì)影響關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)、抗壓特性等。通過TUNEL 實(shí)驗(yàn)和HE 染色我們可以觀察到，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生本體感覺障礙后，關(guān)節(jié)軟骨表面損傷嚴(yán)重，軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨基質(zhì)染色不均，軟骨細(xì)胞凋亡率顯著上升?？梢?，本體感覺障礙能夠促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過模擬膝關(guān)節(jié)本體感覺障礙模型，從基礎(chǔ)病理層面表明了本體感覺缺失可以造成軟骨細(xì)胞過度凋亡，關(guān)節(jié)軟骨退行性改變，有助于膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。