王旭紅，李耀輝，張軍城，李 哲，劉改霞，張 濤，5，張暮盈

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710000；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心 北京 100700；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；5.安康市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 安康 725000）

發(fā)熱是指致熱原作用于體溫調(diào)節(jié)中樞導(dǎo)致體溫中樞功能紊亂或者其他各種原因引起的產(chǎn)熱過多、或伴隨散熱減少所引起的體溫升高超過正常范圍［1］。發(fā)熱不是一個獨立的疾病，而是其他多種疾病發(fā)生過程中所伴隨的臨床中最常見的癥狀，如感染、癌癥以及免疫性疾病等［2-4］。引起該癥狀的具體機制尚不明確，但是學(xué)者認為發(fā)熱是由外源性致熱源與宿主受體結(jié)合后激活靶細胞，產(chǎn)生和釋放內(nèi)源性致熱源，最終引起發(fā)熱［5］。外源性致熱源包括病原微生物、抗原抗體復(fù)合物、類固醇以及其他致炎物質(zhì)，內(nèi)源性致熱原包括IL1β、IL6 和TNF-α 等細胞因子［6］。這些內(nèi)源性致熱源誘導(dǎo)發(fā)熱的下游介質(zhì)激活環(huán)氧合酶（COX-2）介導(dǎo)花生四烯酸酶促轉(zhuǎn)化為前列腺素H2（PGH2），進一步導(dǎo)致前列腺素E2（PGE2）的產(chǎn)生，PGE2 是熱反應(yīng)的最終致熱介質(zhì)［7］。臨床中最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物布洛芬，其作用機制就是抑制COX2，減少前列腺素合成，通過下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞而發(fā)揮解熱作用。除西藥外，臨床中最常用的中成藥退熱劑就是柴胡注射液，常單用或與復(fù)方氨林巴比妥聯(lián)用。

柴胡屬于中藥學(xué)解表藥中的疏散風(fēng)熱藥，其味苦、性辛微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有解表退熱的功效［8］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》指出柴胡主心腹，去腸胃中結(jié)氣……寒熱邪氣，推陳致新?！端幮哉摗分赋霾窈鲿r疾內(nèi)外熱不解，單煮服。《醫(yī)學(xué)啟源》指出柴胡除虛勞煩熱，解散肌熱，去早晨潮熱?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明柴胡具有解熱、抗病毒、抗細菌內(nèi)毒素、抗炎、抗腫瘤和提高免疫力的作用［9］。中藥柴胡具有多種有效成分，每種成分所對應(yīng)的靶點較多，該藥對多種疾病都有治療作用。目前已發(fā)表的文獻中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法介紹了小柴胡湯治療發(fā)熱的作用機制，但是通過對symmap 數(shù)據(jù)庫（https：//www.symmap.org/search/）進行檢索發(fā)現(xiàn)小柴胡湯中對發(fā)熱有效的中藥僅有柴胡一味，而且臨床中也廣泛的使用柴胡注射液治療發(fā)熱。為進一步闡釋柴胡干預(yù)發(fā)熱的作用機制，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從數(shù)據(jù)庫中提取藥物和疾病的靶點，對靶點進行分析從而得出柴胡治療發(fā)熱的關(guān)鍵靶點及其可能的作用通路。

1 材料與方法

1.1 柴胡的靶點預(yù)測

首 先 利 用TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索小柴胡湯中所有藥物的有效成分和靶點，然后利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對收集到的化合物對應(yīng)的靶點信息進行標準化處理，最后刪除重復(fù)的化合物和靶點信息。本研究為了更加全面的分析柴胡的作用機制，不采用任何ADME 參數(shù)對有效成分進行篩選，將檢索到的有效成分和靶點信息全部納入后續(xù)分析。

1.2 發(fā)熱的靶點預(yù)測

利用OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/search/advanced/geneMap）、disGeNET 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www. disgenet. org/search）、GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/）和symmap 數(shù)據(jù)庫，并以“Fever”為關(guān)鍵詞進行檢索。將上述多個數(shù)據(jù)庫的靶點進行匯總，并刪除重復(fù)的靶點即可得到疾病的靶點。最后采用R 3.6.3 將柴胡的靶點與發(fā)熱的靶點進行映射，得到的交集靶點被認為是核心靶點。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以HINT 數(shù)據(jù)庫（http：//hint.yulab.org/）所下載的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)為背景，利用Cytoscape 3.6.0 完成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。其中HINT 數(shù)據(jù)庫是由8 個相互作用組資源（BioGRID、MINT、iRef-Web、DIP、univent、HPRD、MIPS 和PDB）的高質(zhì)量蛋白質(zhì)相互作用匯編，課題組成員手動地過濾以消除錯誤的和低質(zhì)量的相互作用，并且保持實時更新。

1.4 核心靶點的GO 富集分析和KEGG 富集分析

采用R 3.5.3 軟件bioconductor 程序包給關(guān)鍵靶點名稱轉(zhuǎn)換為ID，然后再利用bioconductor 程序包對轉(zhuǎn)換后的ID 進行GO 富集和KEGG 富集，在輸入的命令中按照P＜0.05，Q＜0.05 進行GO 富集和KEGG 富集過程的篩選。

2 結(jié)果

2.1 柴胡有效成分及靶點預(yù)測

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行重要有效成分和靶點的提取，共得到小柴胡湯有效成分726 種，其中柴胡有效成分215 種。紅色部分表示柴胡的有效成分，藍色部分表示小柴胡湯的有效成分，見圖1。將有效成分對應(yīng)的靶點采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行標準化，并刪除重復(fù)的靶點，共得到小柴胡湯靶點677 種，柴胡靶點516 種。紅色部分表示柴胡的靶點，藍色部分表示小柴胡湯的靶點，見圖2。

圖1 藥物有效成分圖Fig 1 Effective components of drugs

圖2 藥物靶點圖Fig 2 Drug target map

2.2 發(fā)熱靶點及核心靶點預(yù)測

通過對1.2 中四個疾病數(shù)據(jù)庫進行檢索，將檢索結(jié)果進行匯總并刪除重復(fù)的靶點后共得到疾病靶點7 305 個。然后利用R 軟件VennDiagram 程序包對柴胡的靶點、小柴胡湯的靶點以及發(fā)熱的靶點取交集，最終得到交集靶點400 個，它們可能是治療發(fā)熱的核心靶點。紫色部分為發(fā)熱的疾病靶點，綠色部分為小柴胡湯的靶點，黃色部分為柴胡的靶點，重疊的部分為交集靶點，見圖3。

圖3 靶點Venn 圖Fig 3 Venn diagram of target

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以HINT 數(shù)據(jù)庫中的蛋白互作關(guān)系為背景網(wǎng)絡(luò)，共有12 190 各節(jié)點，64 120 條邊；首先將小柴胡湯的靶點影射其中并選中與鄰近靶點的關(guān)系，共得到3 906 個節(jié)點，28 232 條邊；再將柴胡的靶點影射其中，共得到380 個節(jié)點，369 條邊；最后將2.2 中所得交集靶點影射其中共得到310 個節(jié)點，322 條邊。見圖4。對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAPDH、AKT1、INS、IL-6、VEGFA 等 節(jié) 點 連 接 度 較高，可能核心靶點。將所得到的的310 個節(jié)點映射到柴胡的靶點中，逆向?qū)ふ抑匾幕衔?，按照?jié)點度值＞4 進行化合物和靶點的篩選，從圖中可以看出最重要的化合物為槲皮素（quercetin）、醋酸（acetic acid）以及葛根素（puerarin），重要的靶點為PTGS2、GABRA1、NCOA2 和ADH1B。見圖5。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 4 PPI network

圖5 柴胡治療發(fā)熱的重要靶點和化合物Fig 5 Important targets and compounds of Bupleurum

2.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

在2.2 和2.3 的結(jié)果中分別的到兩個交集的靶點，但是2.3 中結(jié)果是基于HINT 數(shù)據(jù)庫中的高質(zhì)量蛋白互作關(guān)系，因此為了使本研究結(jié)果更加可靠，GO 富集分析和KEGG 富集分析采用2.3 中所得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶點為基礎(chǔ)。采用R 軟件bioconductor 程序包進行GO 富集分析，結(jié)果顯示共富集為185 個有顯著意義的條目，其中輔因子結(jié)合（cofactor binding）以及輔酶結(jié)合（coenzyme binding）明顯優(yōu)于其他的富集條目。見圖6。KEGG 富集結(jié)果共分為177 個有顯著意義的條目，主要涉及EB 病毒感染、乙型肝炎等感染相關(guān)的信號通路，前列腺癌、膀胱癌、肺癌等癌癥相關(guān)的通路，內(nèi)分泌抵抗、同種異體排異反應(yīng)等代謝相關(guān)的信號通路。見圖7。

圖6 GO 富集分析Fig 6 Go enrichment

圖7 KEGG 富集分析Fig 7 KEGG enrichment

3 討論

發(fā)熱是感染科和呼吸科最常見的疾病，發(fā)熱的原因也是多種多樣的，其中有感染因素引起的，也有非感染因素引起的［10］。不同因素導(dǎo)致的發(fā)熱都以針對病因治療為主，但是對于一些不明原因的發(fā)熱或者發(fā)熱早期病因尚未明確時多以對癥治療為主［11］。臨床中常用的退熱劑包括口服布洛芬，肌肉注射安痛定或者肌肉注射柴胡注射液，在低至中度發(fā)熱時，尤其是在胃部不適的患者中中成藥柴胡注射液使用較為廣泛，在高熱以及超高熱時柴胡注射液聯(lián)合安痛定注射液使用更加廣泛［12］。柴胡自古以來就被用于各種發(fā)熱性疾病的治療，如《傷寒論》小柴胡湯、《傷寒六書》柴葛解肌湯等，對于本次新型冠狀病毒疫情發(fā)熱的文獻可以看出基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的小柴胡湯分析發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯對于發(fā)熱癥狀具有較好的療效［5］。而本研究前期針對小柴胡湯采用symmap 數(shù)據(jù)庫檢索對發(fā)熱具有治療作用的中藥，最后發(fā)現(xiàn)該方中僅有柴胡一味中藥具有干預(yù)發(fā)熱的作用，通過臨床實踐及文獻研究發(fā)現(xiàn)在多個治療發(fā)熱的方劑中柴胡有著舉足輕重的地位。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法詳細的探討柴胡的解熱機制。

首先，本研究采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫提取小柴胡湯及柴胡的有效成分及靶點，其中柴胡的有效成分約占小柴胡湯所有有效成分的1/3，但是柴胡的靶點卻約占小柴胡湯作用靶點的2/3。通過核心靶點逆向推到重要的化合物，可看出醋酸、槲皮素、葛根素為節(jié)點度值最高的化合物，重要的靶點為PTGS2、GABRA1、NCOA2 和ADH1B。其中醋酸作為一種復(fù)合調(diào)味料，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也認為其具有良好活性的抗微生物制劑，因為它能夠降低微生物存活所必須的PH 值［13］；槲皮素是一種黃酮類化合物，現(xiàn)代研究認為該成分具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用［14］；葛根素屬于異黃酮類衍生物，現(xiàn)代藥理學(xué)認為其具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤的作用［15］。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（PTGS）又稱環(huán)氧合酶，是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，PTGS 有兩種同工酶：組成型PTGS1 和誘導(dǎo)型PTGS2，它們對表達和組織分布的調(diào)節(jié)不同，其中PTGS2 負責炎癥前列腺素的產(chǎn)生，PTGS2 的上調(diào)還與細胞黏附增加、表型改變、抗凋亡和腫瘤血管生成有關(guān)。發(fā)熱是由外源性致熱源（細菌、病毒等等）與宿主受體結(jié)合后激活靶細胞，產(chǎn)生和釋放內(nèi)源性致熱源，最終引起發(fā)熱［16］。而通過靶點反向?qū)ふ业幕衔镏泄?jié)點度值較高的三個化合物，對于細菌、病毒等外源性致熱源均有不同程度的抑制作用；PTGS2 負責前列腺素的產(chǎn)生，而前列腺素是導(dǎo)致發(fā)熱的重要介質(zhì)，因此這些化合物和靶點在柴胡發(fā)揮解熱作用中的主要成分和靶點。

然后，對核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析GAPDH、AKT1、INS、IL-6、VEGFA 是網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，GAPDH 編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白家族的一個成員，它能執(zhí)行機械上不同的功能，該蛋白質(zhì)具有對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌具有抗菌活性［17］。AKT1 編碼的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶以抑制細胞凋亡，而后磷酸化并使凋亡機制的組成部分失活［18］。IL-6 編碼的蛋白質(zhì)被證明是一種內(nèi)源性熱原，能夠在自身免疫性疾病或感染患者中引起發(fā)熱［19］。VEGFA 在血管生成以及內(nèi)皮細胞生長中的發(fā)揮重要作用，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、細胞遷移，抑制細胞凋亡，誘導(dǎo)血管通透性增加［20］。核心靶點的KEGG 富集分析結(jié)果顯示靶點多數(shù)均富集在感染、癌癥、免疫性性疾病相關(guān)的通路，也從另一方面表明柴胡可能對多種疾病引起的發(fā)熱過程均有治療作用。

綜上所述，柴胡有效成分及靶點的現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示該藥物具有抗感染、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)作用，而且柴胡及發(fā)熱的交集靶點所構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值前五的靶點中四個與炎癥及腫瘤密切相關(guān)，所富集的通路中多數(shù)也與感染、腫瘤及免疫性疾病密切相關(guān)。因此，柴胡可以通過多靶點、多維度發(fā)揮發(fā)熱的作用。