楊小蓉，蔡祥勝，盧漢威，黃演婷，陳小明

1 廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院 廣東廣州 510080

2 中國科學院大學深圳醫(yī)院（光明）醫(yī)學實驗中心 廣東深圳 518000

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種含有部分DNA雙鏈的嗜肝包膜病毒，其大包膜蛋白的N-末端與肝細胞基地外側區(qū)的受體-牛黃膽酸鈉多肽（NTCP）相互作用實行細胞粘附和病毒進入[1]，宿主被感染后其免疫系統(tǒng)與HBV經過一系列復雜的免疫反應過程后，一般會出現三種情況：①HBV病毒DNA整合到宿主細胞中，引發(fā)長期慢性持續(xù)性炎癥細胞浸潤可發(fā)展為慢性乙型肝炎、肝硬化，甚至肝癌；②宿主直接清除病毒；③宿主與病毒長期平衡狀態(tài)，即攜帶者。亦即中醫(yī)診療中的“邪正相爭”。宿主基因HLA-A24及CW1與慢性乙型肝炎不同中醫(yī)證型的相關研究尚未見報道，本研究擬通過檢測宿主基因HLA-A24，CW1、乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）及生化指標丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的變化，并分析各因素與慢性乙型肝炎中醫(yī)證型的相關性，為臨床診療提供一個方向。

資料與方法

1 入組標準

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準 參照2005年第6次全國傳染病與寄生蟲病會議修訂的《病毒性肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎診斷標準[2]。

1.1.2 中醫(yī)辨證分型診斷標準 參照1991年中國中醫(yī)藥學會肝病專業(yè)委員會制定的辨證標準（試行）中慢性乙型肝炎的中醫(yī)辨證標準[3]，分為肝膽濕熱證，肝郁脾虛證，肝腎陰虛證，瘀血阻絡證及脾腎陽虛證5個證型。

1.2 納入標準 ①HBsAg陽性時間持續(xù)超過6個月，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平升高達正常值2倍以上；②年齡19～77歲，性別不限；③簽署知情同意書。

1.3 排除標準 ①甲、丙、丁、戊型肝炎的重疊感染；②EB（EPstein-Barr）病毒、巨細胞病毒（CMV）感染；③藥物性肝損傷、中毒性肝損傷、自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝，無干擾素治療史；④有心腦血管、肺、腎、內分泌及造血系統(tǒng)嚴重原發(fā)性疾?。虎菹嚓P指標不完整者。

2 一般資料

該研究經醫(yī)院倫理委員會批準，98例病例為2011年4月-2012年4月在廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院感染科就診的慢性乙型肝炎患者，其中男88例，女10例，年齡27～78歲，平均年齡（50.06±11.0）歲；肝膽濕熱證型24例（24%），肝郁脾虛證型15例（15%），肝腎陰虛證型18例（18%），瘀血阻絡證型31例（31%），脾腎陽虛證型10例（10%）。40例健康對照來自于接種過乙肝疫苗并產生表面抗體的健康人群，男16例，女24例，年齡19～81歲，平均（44.3±21.2）歲，各組在性別及年齡上的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 觀察指標及檢測方法

3.1 標本收集 抽取患者靜脈血4ml，用于檢測HBV DNA及ALT及AST，再抽取EDTA-Na抗凝全血2ml，采用酚-氯仿-異戊醇方法提取白細胞中DNA，為后續(xù)檢測基因HLA-A24，CW1備用。

3.2 HBV DNA定量檢測 分離血清后按照使用說明書，實時熒光定量-PCR法檢測血清中HBV DNA的含量，儀器為DA-7600，試劑購買于中山大學達安基因有限公司，檢測下限為500U/ml。

3.3 肝功能指標ALT及門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測 標本按照標準操作采集空腹血清或肝素鈉抗凝血漿，運用底物法檢測各證型病例及對照組血清中的ALT及AST，儀器為全自動生化分析儀日歷-7180，試劑購買于四川邁克生物股份有限公司。

3.4 HLA-A24，HLA-CW1基因定量檢測 引物合成及測序均在上海生物工程公司完成，電泳儀為北京六一儀器廠，熒光定量PCR儀應用美國ABI公司的ABI-7500，pMD載體為日本TAKARA公司產品，在HLA-A24第一外顯子序列（Genbank登錄號：AH004915.2）CDS區(qū)域設計上下游兩個引物及Taqman 探 針：5’-TTCTCA CACCGTCCAGAGGAT-3’，5’-GAGCGCAGGTCCTCTTTCAG-3’，FAM-5’-TCGGACTGGCGCTTCCTCCG-3’-TAMRA；HLA-CW1基因（GenBank登錄號：AH0117 49.2）CDS區(qū)設計上下游兩個引物及Taqman探針：5’-GCTCCCACTCCATGAAGTATTTCT-3’，5’-CTGTCGAACCGCACGAACT-3’；通過普通PCR擴增出184bp和171bp的片段后，連接，轉化，測序，酶切鑒定后，運用載體pMD20/HLA-A24/CW1，按 照 104～ 107copies/ml稀釋倍數稀釋，實時熒光定量PCR檢測各稀釋倍數質粒（反應條件：95℃變性 30s，95℃ 5sec，60℃退火 30sec，30個循環(huán)）。最后制作標準曲線，檢測各證型HLAA24、CW1基因含量。

4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD進行各組均數多重比較，相關性分析采用線性相關分析法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 慢性乙型肝炎中醫(yī)證型分布情況

慢性乙型肝炎患者的常見證型為瘀血阻絡型和肝膽濕熱型，分別各占32%和25%，性別比例中以男性占比較多，為90%，女性占比為10%，中醫(yī)證型分布于性別的差異無統(tǒng)計學差異，見表1。

表1 98例慢性乙型肝炎患者不同性別中醫(yī)證型 分布情況

2 各證型HBV-DNA、ALT及AST定量結果比較

HBV-DNA定量結果以肝膽濕熱及肝郁脾虛證型較高，肝腎陰虛、瘀血阻絡及脾腎陽虛證型較低，各組相比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.918）；ALT結果各組間比較，脾腎陽虛證型高于與其他各證型（P<0.05），即脾腎陽虛證>肝膽濕熱證> 肝郁脾虛證>瘀血阻絡證>肝腎陰虛型；AST結果各組間相比較，尤以脾腎陽虛為最高，且高于其它證型（P<0.05），其次為肝郁脾虛、瘀血阻絡、肝膽濕熱及肝腎陰虛證，見表2。

表2 各證型HBV-DNA、ALT及AST值比較 （±s）

表2 各證型HBV-DNA、ALT及AST值比較 （±s）

注： 與其它組比較，* P<0.05

證型分類 例數 HBV-DNA/U·ml-1 ALT/U·L-1 AST/U·L-1肝膽濕熱型 24 2.13±0.70 44±16.92 42±10.62肝郁脾虛型 15 2.03±0.66 41±10.56 63±16.99*肝腎陰虛型 18 1.64±0.68 34±9.85 31±8.04瘀血阻絡型 31 1.72±0.46 35±8.46 44±10.09脾腎陽虛型 10 1.70±0.95 62±11.25* 115±40.24*

3 各證型HLA-A24，HLA-CW1基因檢測結果比較

各證型HLA-A24基因表達以正常對照組表達最高，脾腎陽虛證型表達最低，肝膽濕熱證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡證及脾腎陽虛證型與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），肝郁脾虛證與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；HLA-CW1基因表達以對照組表達結果最高，肝膽濕熱證型表達最低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而其它各組結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

表3 各證型HLA-A24及CW1結果 （±s）

表3 各證型HLA-A24及CW1結果 （±s）

注：與正常對照比較，*P<0.05

證型分類 例數 HLA-A24 HLA-CW1肝膽濕熱型 15 2.32±1.62* 1.81±1.21*肝郁脾虛型 18 3.23±1.95 2.71±1.86肝腎陰虛型 31 2.46±1.63** 2.28±1.20瘀血阻絡型 10 2.48±1.73* 2.05±1.55脾腎陽虛型 24 1.19±0.91* 2.66±1.75對照組 40 4.10±1.69* 2.89±1.68*

4 各客觀指標相關性分析

應用SPSS17.0將各相關因素進行分析，ALT和AST與HBV-DNA呈顯著正相關（P<0.05），HLA-CW1與HLA-A24基因成顯著正相關（P<0.05），見表4。

表4 各組HBV-DNA、ALT、AST、HLA-A24及CW1相關性分析

討 論

中醫(yī)學認為乙型病毒性肝炎屬于“黃疸”“脅痛”“積聚”“鼓脹”“郁證”等疾病范疇，歸因于疫毒浸淫肝膽，而肝疏泄失常，無法鼓邪外出，導致濕熱疫毒留滯體內而發(fā)病[4]。ALT和ASTS是反映肝功能最常見的兩個指標，ALT主要存在于肝細胞漿中，當宿主被感染乙肝病毒后，肝細胞在病毒的侵蝕下表現為通透性增加，ALT從肝細胞逸出，從而引起肝細胞變性損傷，引起一系列臨床癥狀；AST主要分布于肝細胞線粒體中，少數分布于細胞質中，當肝細胞病變嚴重甚至壞死時，AST即會從肝細胞線粒體中釋放出來到血液中被檢測出來；在臨床上，HBV-DNA是檢測HBV感染最直接而特異性又很高的指標，通常載量越高，表示病毒復制越厲害，傳染性越強。本研究發(fā)現慢性乙型肝炎中醫(yī)證型主要以肝膽濕熱和淤血阻絡證型較為多見，分別為24%和32%，這與陳瑞年的研究[5]中以濕熱內結和肝郁脾虛證型占比最多的結果有差異，可能與本研究收集的樣本數過少有關；ALT在脾腎陽虛及肝膽濕熱證型中值大于正常參考范圍，與其它證型之間相比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05），AST則是在脾腎陽虛及肝郁脾虛證型中表現為大于正常參考范圍，與另外三種證型相比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明脾腎陽虛證型肝細胞損傷比較嚴重，其次為肝郁脾虛，肝膽濕熱，肝腎陰虛和淤血阻絡證型，這與劉二麗的研究[6]ALT和AST在濕熱內結和脾腎陽虛證型明顯升高的結果一致，與吳禮鋒的研究[7]有一些差異；本研究中各證型HBV-DNA的結果以肝膽濕熱和肝郁脾虛證型較高，各證型之間相比較結果無統(tǒng)計學意義，結果與黃繼琴[8]、姜楠[9]的研究結果一致。相關性分析發(fā)現ALT和AST與HBV-DNA呈顯著正相關（P<0.05），表明肝膽濕熱證型在早期會出現肝細胞損傷，隨著病情進展，到了肝郁脾虛、肝腎陰虛、淤血阻絡和脾腎陽性證型后，宿主驅邪無力，邪毒聚增，造成肝細胞損傷從細胞漿到線粒體，進而大量病毒釋放到血漿中，出現了HBV-DNA拷貝數增加的病況，而HBV-DNA拷貝數的增減則慢性乙型肝炎治療的一個指標。

人 類 白 細 胞 抗 原（Human Leukocyte Antigen，HLA）是一組由具有高度多態(tài)性和連鎖不均衡的基因群體而構成的人類主要組織相容性復合體，也是調控人體特異性免疫應答和決定疾病易感性個體差異的主要基因系統(tǒng)。Ayse Albayrak等將257例土耳其人分為對HBV疫苗有應答組和無應答組，發(fā)現應答組的HLA-A24基因頻率顯著高于無應答組[10]，即HLA-A24基因與宿主對乙肝疫苗的反應性有關。亦有研究表明，HLA-A24與CW1與臨床應用利巴韋林治療的轉歸息息相關[11]，宿主自身的HLA-A24與HBV相關性慢性肝炎呈低風險關系[12]。本研究中各證型與自動產生乙肝保護性抗體的對照組相比較，差異有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.05），脾腎陽虛證型結果最低，而肝膽濕熱、肝郁脾虛、肝腎陰虛及瘀血阻絡證型結果相對較高，也證實了HLA-A24基因與疫苗的反應性及病程的轉歸均有關聯性。本研究中的HLA-CW1結果以肝膽濕熱證型最低，與其它證型相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明慢性乙型病毒性肝炎的病程發(fā)展是肝膽濕熱-肝郁脾虛-肝腎陰虛-瘀血阻絡-脾腎陽虛這樣一個路徑。

宿主感染HBV后，即濕熱疫毒侵入機體，是乙型肝炎慢性化的外因與宿主自身的免疫因素相互作用，即邪正交爭，根據其各自的力量交鋒后，出現彼此消長盛衰的變化，導致了病毒感染宿主后不同的發(fā)展和轉歸。起始階段肝郁脾虛、肝膽濕熱階段為自身免疫

功能與病毒處于正邪相交的階段，可能此時及時治療應該是比較合適的時機，通過檢測宿主自身HLA基因亦可為臨床注射HBV疫苗是否出現應答，甚至判斷藥物的療效提供一個方向性指導。