秦艷芳,趙冰欣,李曉姣,徐風云,吳 昊*
(1.長治幼兒師范高等??茖W校,山西 長治046000;2.山西師范大學 化學與材料科學學院,山西 臨汾041004)
卡維地洛(Carvedilol,CAR,圖1)屬于α和β受體阻斷劑,可擴張血管,保護心肌和神經(jīng)元,在臨床上廣泛用于高血壓、心絞痛和心力衰竭等疾病的治療,能顯著降低心血管患者的發(fā)病率和死亡率[1-2]。
圖1 卡維地洛的結構式Fig.1 The structure of carvedilol
磁固相萃取(MSPE)是21世紀發(fā)展起來的一項新型固相萃取技術,與傳統(tǒng)的固相萃取相比,具有操作簡便快速、成本低等優(yōu)點[3-4]。共價有機骨架材料(COFs)是一類由輕質(zhì)元素通過共價鍵連接的新型多孔有機材料,具有化學和熱穩(wěn)定性良好、比表面積大和孔徑可控等優(yōu)點[5],在樣品預處理領域具有廣闊的應用前景[6]。
本研究采用Fe3O4納米材料、1,3,5-三甲基間苯三酚(Tp)和聯(lián)苯胺(BD),通過溶劑熱法合成了Fe3O4@COF(TpBD)復合材料。相比已有文獻[7],其合成方法所用試劑少,過程簡單易操作,實驗成本低。以Fe3O4@COF(TpBD)為MSPE吸附劑聯(lián)合熒光分光光度法建立了一種檢測血漿和尿液中的CAR含量的新方法,通過優(yōu)化相關實驗參數(shù),在最優(yōu)實驗條件下對該分析方法進行了評估。
FeCl3·6H2O、乙二醇、無水乙酸鈉、1,2-乙二胺、1,3,5-三甲基間苯三酚(Tp)、聯(lián)苯胺(BD)(上海阿拉丁生化科技有限公司);無水乙醇、冰醋酸、高效液相色譜級甲醇、乙醇、乙腈(北京百靈威科技有限公司);CAR標準物質(zhì)(中國藥品生物制品檢定所);尿液及血漿取自長治幼兒師范高等??茖W校校醫(yī)院。
Cary Eclipse熒光分光光度計(Agilent Technologies,美國);pHS-3C pH計(上海強生科技有限公司);KQ-500DV超聲波洗滌器(江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(JEOL,日本);D8 Advance X射線衍射儀(XRD)(Bruker,德國);7407振動樣品磁強計(Lake Shore,美國);FT-IR360傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)(Nicolet,美國);ASAP 2020比表面和孔隙度分析儀(Micromeritics,美國)。
熒光測量條件:(25±0.5)℃;λex=240 nm,λem=356 nm;激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm;掃描速度為1 000 nm·min-1。
Fe3O4納米材料參照文獻[4]制備:將1.0 g FeCl3·6H2O分散于20 mL乙二醇中超聲處理,隨后緩慢加入3.0 g無水乙酸鈉,磁力攪拌30 min;加入10 mL 1,2-乙二胺攪拌30 min后,將混合溶液移至高壓反應釜中加熱至200℃并保持8 h,自然冷卻至室溫。最后將黑色產(chǎn)物用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次,并在真空烘箱中60℃干燥24 h。
Fe3O4@COF(TpBD)復合材料通過溶劑熱法制備:取60 mg Fe3O4加至30 mL無水乙醇中超聲分散,然后依次加入63 mg(0.3 mmol)Tp和55.2 mg(0.3 mmol)BD,混合物超聲35 min后,移至高壓反應釜中加熱至180℃,保持48 h。最后將產(chǎn)物用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次,并在真空烘箱中60℃干燥24 h。
CAR標準溶液(0.1 mg/mL):精確稱取10 mg CAR,加1 mL的冰醋酸溶解,再加適量超純水定容至100 mL。
血樣處理:在具塞離心管中依次加入10 μL不同質(zhì)量濃度的CAR標準溶液、2.0 mL血漿和8 mL乙腈脫蛋白,以4 000×g離心15 min。收集透明的上清液,待測。
尿樣處理:在具塞離心管中依次加入10 μL不同質(zhì)量濃度的CAR標準溶液和10 mL新鮮人尿,4 000×g離心10 min。收集透明的上清液,待測。
準確稱取5 mg吸附劑Fe3O4@COF(TpBD)置于50 mL含CAR樣品溶液的比色管中,超聲4 min,將釹鐵硼磁鐵置于比色管底部對吸附劑進行分離,棄去上清液后,將吸附劑在40℃氮氣中吹干。然后準確量取0.5 mL乙醇置于比色管底部進行解吸,超聲5 min后使用釹鐵硼磁鐵分離解吸劑和吸附劑,重復解吸步驟2次,合并兩次解吸劑。最后將解吸劑用0.22 μm的針式過濾器過濾,濾液用于熒光分析。
利用TEM分別對Fe3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的形貌進行了表征。如圖2A與圖2B所示,F(xiàn)e3O4呈球形,且大小均勻,表面被COF(TpBD)均勻包裹。元素分布圖像(圖2C)也表明Fe3O4@COF(TpBD)中Fe3O4(元素Fe、O)和COF(TpBD)(元素C、N、O)均勻緊密地結合。
由Fe3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的N2吸附-解吸等溫線(圖2D)可知,F(xiàn)e3O4的BET比表面積和孔體積分別為11.00 cm2/g和0.14 cm2/g,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)的分別為32.26 cm2/g和0.18 cm3/g,相比Fe3O4均明顯增加。
Fe3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的磁化曲線(圖2E)表明,兩者均具有良好的磁性能,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)的飽和磁化強度為27.7 emu/g,在外磁場作用下容易分離。
從Fe3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的XRD譜圖(圖2F)可以看到,F(xiàn)e3O4有6個特征峰(2θ=30.1、35.3、43.1、53.2、57.0、62.4)分別對應于(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面,COF(TpBD)在2θ=25.5處的特征峰對應其(001)晶面。Fe3O4@COF(TpBD)圖譜中這兩種材料的峰都有體現(xiàn),說明二者形成了復合材料,同時結晶度未發(fā)生變化。
如Fe3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的FT-IR譜圖(圖2G)所示,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)在584 cm-1處的吸收帶為Fe—O振動,3 432 cm-1和1 442 cm-1處的吸收帶分別是O—H基團和芳香C====C單元的特征拉伸帶,1 292 cm-1和1 605 cm-1處吸收帶分別與C—N拉伸和C====N鍵有關。表明Fe3O4已成功被COF(TpBD)包裹。
圖2 Fe3O4(A)和Fe3O4@COF(TpBD)(B)的TEM圖,F(xiàn)e3O4@COF(TpBD)的元素分布圖(C),F(xiàn)e3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的N2吸附-解吸等溫線(D),F(xiàn)e3O4和Fe3O4@COF(TpBD)的磁化曲線(E),F(xiàn)e3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的XRD圖譜(F)以及Fe3O4、COF(TpBD)和Fe3O4@COF(TpBD)的FT-IR圖譜(G)Fig.2 TEM images of Fe3O4 nanocrystal clusters(A)and Fe3O4@COF(TpBD)(B),element mapping images of Fe3O4@COF(TpBD)(C),N2 adsorption-desorption isotherms of Fe3O4 and Fe3O4@COF(TpBD)(D),magnetic curves of Fe3O4 and Fe3O4@COF(TpBD)(E),XRD spectra of Fe3O4,COF(TpBD)and Fe3O4@COF(TpBD)(F),and FT-IR spectra of Fe3O4,COF(TpBD)and Fe3O4@COF(TpBD)(G)
2.2.1 pH值溶液的pH值會對藥物與吸附劑間的吸附平衡產(chǎn)生影響。實驗中溶液的pH值用B-R緩沖溶液調(diào)節(jié)。在溶液pH 2.0~12.0范圍內(nèi)進行MSPE和熒光檢測。結果如圖3A所示,隨pH值的升高,CAR的熒光強度變化不大。為了方便操作,實驗選擇萃取溶液的pH值為6.0。
2.2.2 吸附劑用量考察了吸附劑用量在1~8 mg范圍內(nèi)對熒光強度的影響(圖3B)。結果表明,當吸附劑用量為5 mg時,CAR的熒光強度最大。因此,實驗選用5 mg吸附劑。
2.2.3 萃取時間考察了萃取時間為1~10 min時對CAR熒光強度的影響(圖3C)。結果顯示,熒光強度隨著萃取時間的延長逐漸增加,當萃取時間為4 min時,CAR的熒光強度達到最大值,吸附過程達到平衡。因此,萃取時間確定為4 min。
2.2.4 解吸條件分別考察了乙酸、甲醇、乙醇和乙腈4種有機溶劑對CAR的解吸效果(圖3D)。當選用乙醇為解吸劑時CAR的熒光強度最大。并考察了乙醇用量(0.2~0.8 mL)對CAR熒光強度的影響(圖3E)。結果表明,改變乙醇用量,CAR的熒光強度變化不明顯,為了方便操作,選用乙醇的體積為0.5 mL。另外,采用0.5 mL乙醇為解吸劑,考察了解吸時間在1~10 min范圍內(nèi)時對CAR熒光強度的影響(圖3F)。結果表明,解吸時間為5 min時,CAR熒光強度最大。故選擇最佳解吸時間為5 min。
圖3 溶液pH值(A)、吸附劑的用量(B)、萃取時間(C)、解吸劑(D)、解吸劑的體積(E)和解吸時間(F)對CAR熒光強度的影響Fig.3 Effects of sample solution pH value(A),adsorbent amoun(tB),adsorption time(C),desorption solvent types(D),desorption solution volume(E)and desorption time(F)
在優(yōu)化實驗條件下,考察了某些共存物質(zhì)以及常見離子對CAR(10 ng/mL)測定的影響??刂茰y量誤差在±5%以內(nèi),1 000倍的尿素,800倍的Mg2+,700倍的K+、HPO42-,600倍的Na+、SO42-,400倍的Cl-,160倍的Ac-,120倍的Ca2+,56倍的Al3+,8倍的Cu2+等不會對測定造成干擾??梢娫摲椒ň哂泻芎玫倪x擇性。
在最優(yōu)實驗條件下,制備了一系列CAR溶液,以熒光強度(y)對質(zhì)量濃度(x,ng/mL)繪制標準工作曲線,線性回歸方程為y=8.138x+4.555,R=0.999 2。結果表明方法在1~100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性。CAR的檢出限(S/N=3)為0.19 ng/mL,定量下限(S/N=10)為0.63 ng/mL,對溶液中CAR的富集倍數(shù)為113倍。可見該方法的靈敏度高,線性范圍寬。
為考察方法的重現(xiàn)性,按照磁固相萃取步驟對1 ng/mL CAR標準溶液于日內(nèi)和日間進行6次平行測定。計算結果表明,其日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為3.4%,日間RSD為3.6%。
為了驗證本方法的可行性及有效性,在尿樣和血樣中分別加入高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的CAR標準溶液,經(jīng)“1.3”方法處理后,按照磁固相萃取過程進行加標回收實驗?;厥章蕼y定結果如表1 所示,其范圍為95.9%~98.7%。說明方法的準確性較好,可有效測定尿樣和血樣中CAR的含量。
表1 加標尿樣和加標血樣中CAR的熒光測定(n=3)Table 1 Fluorimetric determination of CAR in spiked urine and spiked plasma(n=3)
相比其他文獻方法(表2),本文所建立的方法線性范圍寬,在加標樣品中回收率高。
表2 生物樣品中CAR檢測方法比較Table 2 Comparison of determination for CAR in biological samples
本研究合成了Fe3O4@COF(TpBD)復合材料,并以Fe3O4@COF(TpBD)作為MSPE吸附劑,聯(lián)合熒光分光光度法建立了一種檢測CAR含量的新方法。結果表明,該方法檢測范圍寬、靈敏度高且回收率好,適用于尿樣和血樣中CAR含量的測定。