王 衛(wèi)，易思富，田 云

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術學院，長沙 410128； 2. 常德炎帝生物科技有限公司，常德 415000)

葛仙米(Nostocsphaeroideskützing)，又名球狀念珠藻，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用藍藻[1]，屬藍藻門(Cyanophyta)、藍藻綱(Cyanophyceae)、段殖藻目(Hormogonales)、念珠藻科(Nostocaceae)和念珠藻屬(Nostoc)[2-5]。人工養(yǎng)殖葛仙米群體為球狀，野生葛仙米主要形狀呈球形膠質(zhì)狀或者其他不規(guī)則形狀，呈墨綠色或者黃褐色[6-7]。葛仙米的主要活性成分有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等[8]。葛仙米對多種自由基具有良好的清除作用，也能夠增強自身的氧化防御體系和抗氧化能力[9]。葛仙米是國家衛(wèi)生健康委員會批準的新食品原料[10]。

葛仙米生活史主要為藻殖段繁殖史[11-12]。藻殖段(hormogonia)是一種由不可移動的藻絲體斷裂而釋放出的許多短而直的可移動的藻絲。其形態(tài)上和營養(yǎng)藻絲體具有明顯區(qū)別，組成藻殖段的細胞內(nèi)具有折光性較強的偽空泡[13]，藻殖段分化是多種金屬離子協(xié)同作用，信號轉(zhuǎn)導參與且復雜的過程[14]。與營養(yǎng)藻絲體相比，藻殖段表現(xiàn)出了更高的對低光高溫應變能力[15]。葛仙米具有多型性，這些多型性既表現(xiàn)在葛仙米生活史中不同發(fā)育階段的多樣性，也表現(xiàn)在不同藻株在生態(tài)型上的多樣性和同一藻株在不同環(huán)境條件下的形態(tài)多樣性。葛仙米可通過藻殖段、出芽、異形胞等進行繁殖，且不同繁殖方式的生活史形態(tài)特征具特殊性[16]。目前，藻殖段繁殖的形態(tài)特征已被廣泛認知，其他繁殖方式的形態(tài)特征僅有零星報道，可見葛仙米的生活史具有在現(xiàn)有研究中還沒有發(fā)現(xiàn)的生理特點。本研究以翡翠綠葛仙米為材料，以誘導翡翠綠葛仙米釋放的藻殖段為發(fā)育起點，采用顯微鏡觀察藻殖段發(fā)育形態(tài)特征，采集分析圖片構(gòu)建翡翠綠葛仙米從藻殖段至藻體破裂的生活史圖譜，為進一步深入研究翡翠綠葛仙米提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從常德炎帝生物科技有限公司葛仙米培植基地中選育，并經(jīng)分類鑒定，保存的翡翠綠葛仙米。

配制BG-110培養(yǎng)基所用試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻殖段誘導

選取粒徑5 mm、形態(tài)圓潤、藻表光滑的翡翠綠葛仙米，用75%乙醇消毒5 s，用無菌蒸餾水洗凈，裝入塑料透明蒸煮袋，加40 mL BG-110液體培養(yǎng)基，抽真空30 s后封口。在37 ℃、光強12 000 Lx的條件下，靜置處理48 h。將藻體撕裂成兩瓣，接于250 mL無菌BG-110液體培養(yǎng)基中，在8 ℃、光強500 Lx的條件下，通氣培養(yǎng)至藻體完全分解，于8 000 r/min離心10 min，收集上清液，獲得藻殖段。

1.2.2 生活史形態(tài)特征觀察

(1)從藻殖段到微球體的生活史形態(tài)特征。將按1.2.1中誘導的藻殖段，稀釋100倍后，接于BG-110固體培養(yǎng)基上，在25 ℃，光強2 000 Lx的條件下，靜置培養(yǎng)，每隔3 d取樣制片，在Olympus BX53顯微鏡下觀察藻殖段發(fā)育成微球體過程中的生活史形態(tài)特征，并用Olympus DP80采集圖像。

(2)微球體出芽生活史形態(tài)特征。將培養(yǎng)獲得的微球體，接于BG-110固體培養(yǎng)基上，在25 ℃，光強5 000 Lx的條件下，靜置培養(yǎng)，每隔3 d取樣制片，在Olympus BX53顯微鏡下觀察微球體出芽繁殖過程中的生活史形態(tài)特征，并用Olympus DP80采集圖像。在繼續(xù)采用BG-110液體培養(yǎng)液通氣培養(yǎng)藻絲體的過程中，取不同培養(yǎng)期的藻體，在體視鏡下觀察并用尺量粒徑并拍照。

1.2.3 圖片整理

在Olympus BX53顯微鏡下觀察并用Olympus DP80采集的圖片，經(jīng)人工初步篩選及分類整理后，用Photoshop CS6剪切處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻殖段生活史形態(tài)特征

將誘導所得藻殖段濾液稀釋100倍接種于BG-110固培養(yǎng)基上，取樣制片，在顯微鏡下觀察(100～1 000倍)，拍照記錄藻殖段發(fā)育過程中的生活史形態(tài)特征，整理分析并構(gòu)建藻殖段發(fā)育為藻絲體的生活史圖譜，其結(jié)果如圖1所示。

(a)藻殖段；(b)兩端異形胞分化，偽空泡消失，藻細胞完成分裂準備；(c)部分細胞橫向分裂；(d)細胞全部橫向分裂成為“雙線期”；(e)細胞分裂增殖，群內(nèi)異形胞分化；(f)藻體膠質(zhì)鞘多位點向內(nèi)凹陷；(g)縊裂成多個球形的微球體；(h)藻絲體。圖1 藻殖段到藻絲體的發(fā)育過程Figure 1 The developmental process from hormogonium to filamentation of seriate colonies

由圖1可知，將藻殖段接于BG-110固體培養(yǎng)基上，在適宜溫度光照下培養(yǎng)過程中，定期取樣制片鏡檢藻殖段發(fā)育的生活史形態(tài)特征。其結(jié)果表明，藻殖段的生活史包括藻殖段階段[圖1(a)]、非絲狀體階段[圖1(b)～(f)]、微球體階段[圖1(g)]及由微球體發(fā)育成內(nèi)部藻絲呈絲狀分布的藻絲體階段[圖1(h)]。其中非絲狀體階段包括以下5個時期：原異形胞分化及細胞分裂準備期[圖1(b)]、細胞橫向分裂期[圖1(c)]、“雙線期”[圖1(d)]、細胞分裂增殖及群內(nèi)異形胞分化期[圖1(e)]和藻體膠質(zhì)鞘多位點向內(nèi)凹陷期[圖1(f)]。以上結(jié)果證實：在藻殖段發(fā)育過程中，可通過非絲狀體內(nèi)凹縊裂增殖來增加微球體數(shù)量，且縊裂受阻會導致微球體畸形和數(shù)量銳減。由此可見，在葛仙米規(guī)?；N過程中，非絲狀體內(nèi)凹橫縊增殖期是調(diào)控微球體畸形率與產(chǎn)量的關鍵期。

2.2 不同長度藻殖段原異形胞分化

將藻殖段接種于BG-110固體培養(yǎng)基上，取樣制片，在顯微鏡下觀察(400倍)，拍照記錄不同長度藻殖段發(fā)育過程中的原異形胞分化，其結(jié)果如圖2所示。

(a)極短藻殖段的原異形胞分化(含5～15個藻細胞)；(b)短藻殖段的原異形胞分化(含20～30個藻細胞)；(c)長藻殖段的原異形胞分化(含30～50個藻細胞)；(d)超長藻殖的原異形胞分化(含50～100個藻細胞)。圖2 不同長度藻殖段發(fā)育中的原異形胞分化(箭頭所示)Figure 2 Original heterocyst differentiation of hormogoniums with various length in the development process (arrow head) 說明：原異形胞為在藻殖段萌發(fā)初期，由組成藻殖段的、未行細胞分裂的藻細胞分化形成的異形胞。如此與組成藻殖段的藻細胞萌發(fā)后經(jīng)數(shù)代細胞分裂，再由子代藻細胞分化的異形胞進行區(qū)別。

2.3 短藻殖段異形胞分化

將長度較短的藻殖段接于BG-110固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取樣制片，在顯微鏡下觀察(400倍)，拍照記錄藻殖段發(fā)育過程異形胞分化特點，其結(jié)果如圖3所示。

(a)端異形胞期；(b)“雙線期”；(c)細胞增殖期；(d)群內(nèi)異形胞分化期。圖3 短藻殖段發(fā)育中的異形胞分化(箭頭所示)Figure 3 Heterocyst differentiation of the short hormogonium in the development process (arrow head)

由圖2和圖3可知，無論藻殖段細胞數(shù)量多少，兩端均會分化出兩個原異形胞。在發(fā)育過程中，藻殖段內(nèi)原異形胞分化與藻殖段細胞數(shù)量有關，組成藻殖段的細胞數(shù)量越多，原異形胞分化越多[圖2(a)～(c)]。但隨細胞數(shù)量的增加[圖3(b)和(c)]，在短藻殖段發(fā)育而來的非絲狀體內(nèi)出現(xiàn)異形胞分化[圖3(d)]。其結(jié)果表明，長藻殖段萌發(fā)時期的藻殖段內(nèi)原異形胞分化和短藻殖段發(fā)育成非絲狀體內(nèi)異形胞分化具有一個共同特點是藻細胞數(shù)量相對較多。由此可見，異形胞分化受細胞數(shù)量促進，是葛仙米藻殖段繁殖調(diào)控的關鍵靶點，這可能與隨藻細胞數(shù)量增多對來自異形胞的促生長因子的需求量增加有關。

2.4 微球體生活史形態(tài)特征

將微球體接種于BG-110固體培養(yǎng)基上，取樣制片，在顯微鏡下(100～1 000倍)觀察，拍照記錄微球體發(fā)育過程生活史形態(tài)特征，整理分析圖片，并構(gòu)建微球體出芽繁殖的生活史圖譜，其結(jié)果如圖4所示。

(a)微球體；(b)“雛芽”；(c)藻絲向芽體內(nèi)移動，芽體增大；(d)內(nèi)凹橫縊，母體與芽體由群間單連藻絲連接；(e)群間單連藻絲內(nèi)的細胞分化為異形胞；(f)異形胞遷移至中部；(g)群間單連藻絲斷裂，細胞凋亡；(h)藻體縊裂，芽體從母體脫落，發(fā)育成藻絲體。出芽關聯(lián)異形胞如圖中箭頭所示。圖4 微球體出芽繁殖過程Figure 4 The process of germinal reproduction of microspheres

由圖4可知，將微球體接于BG-110固體培養(yǎng)基上，在適宜溫度光照下培養(yǎng)過程中，定期取樣制片鏡檢微球體發(fā)育的生活史形態(tài)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)微球體可通過出芽繁殖。出芽過程可分為具有邊緣異形胞分化的微球體[圖4(a)]、雛芽期[圖4(b)]、藻絲向芽體內(nèi)遷移及細胞分裂增殖期[圖4(c)]、群間單連藻絲期[圖4(d)]、群間單連藻絲內(nèi)異形胞分化遷移期[圖4(e)和(f)]和群間單連藻絲斷裂與細胞凋亡期[圖4(g)]。藻體縊裂，芽體脫落進而發(fā)育成成熟的藻絲體[圖4(h)]。其結(jié)果表明，微球體可出芽繁殖，其實質(zhì)為葛仙米藻體進行“藻體分裂”增殖。此外，在出芽過程中的異形胞分化與雛芽形成、芽體從母體脫落前的群間單連藻絲斷裂有關，說明異形胞是葛仙米出芽繁殖調(diào)控的關鍵靶點。

(a)藻絲體；(b)粒徑0.5 mm的藻體；(c)粒徑1 mm的藻體；(d)粒徑2～3 mm的藻體；(e)粒徑3～4 mm的藻體；(f)粒徑4～5 mm的藻體；(g)粒徑6～7 mm的藻體；(h)藻體破裂釋放藻殖段(箭頭所指為藻體破裂形成“潰瘍樣斑”)。圖5 從藻絲體到藻體破裂的發(fā)育過程。Figure 5 Developmental process from the filamentation of seriate colonies to the rupture of the frond

由圖5可知，藻絲體經(jīng)藻絲體→0.5 mm→……→6～7 mm的發(fā)育過程，最終在群體表面出現(xiàn)破裂形成“潰瘍樣斑”，使藻體被逐步分解而釋放出藻殖段。結(jié)果表明：翡翠綠葛仙米生活史還包括隨藻體粒徑增大直至藻體破裂形成藻殖段而開始下一輪生活史的“異徑藻體”階段。

綜上所述，以藻殖段為發(fā)育起點的生活史包括：藻殖段、微球體、藻絲體和異徑藻體4個階段，在異徑藻體發(fā)育過程中，隨藻體粒徑增大直至藻體破裂形成藻殖段而開始下一輪生活史。在藻殖段發(fā)育過程中，有藻殖段繁殖和出芽繁殖，以“藻體分裂”增殖。此外，異形胞分化受藻細胞數(shù)量促進，與出芽繁殖“雛芽”形成和群間單連藻絲斷裂有關，且結(jié)果說明異形胞是葛仙米藻體生長分化調(diào)控的關鍵靶點。

3 討論與結(jié)論

3.1 藻體增殖效應

繁育大量藻種是保證規(guī)?；B續(xù)生產(chǎn)的關鍵。生活史形態(tài)特征研究發(fā)現(xiàn)，翡翠綠葛仙米生活史包括藻殖段發(fā)育到微球體的生活史和微球體出芽繁殖生活史，與鄧中洋等[17]研究發(fā)現(xiàn)葛仙米藻體通過釋放藻絲形成新的藻體和出芽生殖的結(jié)果一致。以“藻體分裂”的方式增殖，即膠質(zhì)鞘兩面內(nèi)凹橫縊到最后縊裂成兩個或多個微球體。微球體再通過出芽繁殖增加藻體數(shù)量，最終發(fā)育為成熟藻絲體，出芽繁殖是增加藻體數(shù)量的主要方式。因此，在葛仙米規(guī)?；a(chǎn)制種過程中，關注葛仙米的“藻體分裂增殖效應”，特別是優(yōu)化促進出芽繁殖的條件，提高微球體出芽率而達到藻種增產(chǎn)的目的，從而更好地滿足規(guī)?；a(chǎn)對藻種的需求。

3.2 異形胞分化

異形胞由營養(yǎng)細胞分化而來，涉及一系列獨特的基因表達程序。魚腥藻PCC 7120是研究異形胞分化的模式生物，大量研究結(jié)果表明，異形胞形成的主要調(diào)節(jié)因子是HetR，異形胞發(fā)育的負調(diào)控因子是HetN，由HetR誘導的異形胞形成所必需的兩個基因為hetP、hepA，CalA是異形胞分化調(diào)控阻遏子，HetR通過磷酸化來控制異形胞的分化。此外，alr1298基因表達、與HetR存在上位性關系的Pkn22激酶、與異形胞糖脂層有關的核苷二磷酸糖差異構(gòu)酶(HgdA)、跨膜蛋白HglK也在異形胞分化發(fā)揮作用。再者，缺氮條件及MgSO4均可促進念珠藻的異形胞的分化，硝酸鈉則抑制異形胞分化[18-25]。本研究結(jié)果表明，異形胞分化受細胞數(shù)量的促進。藻殖段兩端原異形胞分化與藻殖段長度無關，藻殖段內(nèi)的原異形胞數(shù)量與藻殖段長度有關。表現(xiàn)為藻殖段越長，藻殖段內(nèi)異形胞分化越多，在較短藻殖段發(fā)育過程中，隨藻體內(nèi)細胞數(shù)量增加而異形胞分化增多。葛仙米異形胞的功能具有多樣性，異形胞的功能絕非局限于固氮。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在藻殖段萌發(fā)過程中，異形胞參與藻殖段發(fā)育的整個過程，對藻殖段生活史形態(tài)特征的構(gòu)建具有重要作用。在出芽繁殖過程中，異形胞與“雛芽”形成、藻體分裂有關。為滿足不同生理特性需要而出現(xiàn)異形胞的分化，在生活史不同時期分化異形胞可能存在功能上的差異性。在生產(chǎn)實踐中，微觀上調(diào)控基因表達，宏觀上營造缺氮條件，可促使異形胞分化。

3.3 藻體分裂

在生活史形態(tài)特征研究中，在出芽繁殖后期，連接兩個準子藻體的單連藻絲內(nèi)出現(xiàn)異形胞分化而后藻絲在異形胞處斷裂。有研究表明，Yfr1是一種小RNA，是一個重要的細胞壁內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，Yfr1在結(jié)合態(tài)氮缺乏時表達量增加而念珠藻生長受到損害，在異形胞與營養(yǎng)細胞的連接處易于發(fā)生斷裂[26]?？梢?，葛仙米藻絲中營養(yǎng)細胞與異形胞處的斷裂可能與Yfr1基因表達存在必然聯(lián)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，藻體縊裂是非絲狀體分裂成微球體及微球體出芽繁殖芽體脫落的原動力，但從發(fā)育趨勢猜想藻體膠質(zhì)鞘分裂有兩個過程，一是分裂動力可能是“增殖拉伸”，隨芽體內(nèi)細胞增加，芽體體積增大，拉伸內(nèi)凹處膠質(zhì)鞘，且膠質(zhì)鞘向內(nèi)凹陷處細胞凋亡而外分泌膠質(zhì)較少，膠質(zhì)鞘向內(nèi)深度凹陷變細，最終縊裂；二是膠質(zhì)修復，膠質(zhì)鞘具有流動性，通過膠質(zhì)自蠕動修復或是藻體內(nèi)細胞分泌膠質(zhì)修復，維持膠質(zhì)鞘的完整性，使得外層膠質(zhì)鞘不會因藻體分裂而留下創(chuàng)傷面。