蘇賓賓，張佟佟，劉海萍

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 化學(xué)生物學(xué)中心，天津300308)

乙烯，作為全世界最重要的工業(yè)化學(xué)品之一，是各種塑料、橡膠、紡織品以及化學(xué)品等工業(yè)制品的基本原料，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。現(xiàn)階段，乙烯主要是通過石油裂解工藝獲得。然而，在石油化工生產(chǎn)乙烯的同時(shí)，消耗了大量不可再生的化石能源并且排放出二氧化碳、二氧化硫、硫化銨等廢氣污染物，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[3]。因此，開發(fā)乙烯生物合成途徑成為合成生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

微生物如丁香假單胞菌[4-6](Pseudomonassyringae)和指狀青霉[7](Penicilliumdigitatum)具備乙烯合成途徑，該途徑是以α-酮戊二酸(2-oxoglutarate，2-OG)和精氨酸(L-Arg)為底物，經(jīng)乙烯合成酶(Ethylene forming enzyme，EFE)催化生成乙烯。同時(shí)，該反應(yīng)還會(huì)生成1-吡咯啉-5羧酸鹽(1-pyrroline-5-carboxylate, P5C)。這種乙烯合成途徑對(duì)微生物沒有毒害作用，而且比植物途徑[8-9]更簡(jiǎn)單。因此，在乙烯生物合成途徑的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中，微生物來源的乙烯合成酶潛力巨大。

目前，活性最高、研究最多的乙烯合成酶僅來源于Pseudomonassyringaepv.phaseolicolaPK2[10-11](PsEFE，Kudzu strain)，在將該種屬efe基因引入藍(lán)藻[12-14]表達(dá)體系中后，通過改進(jìn)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子、優(yōu)化代謝通路、優(yōu)化表達(dá)條件等方式使得乙烯產(chǎn)量有所提高[15-16]，但由于酶本身催化活性限制，產(chǎn)率較低，無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。此外，PsEFE在酶促反應(yīng)過程中表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用，這成為它在未來工業(yè)化應(yīng)用中的負(fù)面因素[17]。因此，需要深入挖掘催化活性更高、催化性能更好的乙烯合成酶并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析研究[18]。

本研究對(duì)不同微生物中乙烯合成酶(EFE)同源基因的篩選，實(shí)現(xiàn)了6種不同種屬來源efe基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的異源表達(dá)，通過金屬離子螯合親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析3種純化方法制備得到了高純度EFE目的蛋白，并且利用氣相色譜法與茚三酮顯色法測(cè)定了各個(gè)種屬EFE純酶比酶活。成功獲得了一種Neofusicoccumparvum(NpEFE)來源的高活性乙烯合成酶。通過選用不同pH緩沖液確定了高活性NpEFE催化反應(yīng)最適pH條件，并對(duì)其底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)做了研究分析。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

根據(jù)EFE的基因進(jìn)化樹，除Pseudomonassyringaepv.phaseolicolaPK2(PsEFE)外，另選取5個(gè)不同種屬來源的efe同源基因(表 1)，委托GenScript公司合成。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)購自北京全式金公司。

1.2 主要試劑

PCR試劑、T4 DNA連接酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI以及蛋白Marker均購自Takara公司。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑購自北京索萊寶科技有限公司。HisTrap HP組氨酸標(biāo)記親和層析柱、HiTrapTMQ HP和SuperdexTM200 pg分子篩層析柱購自GE healthare公司。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建

以GenScript公司合成的基因?yàn)槟０?，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因片段,所用引物由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所合成(表 2)。純化PCR產(chǎn)物并經(jīng)NdeI、XhoI限制性內(nèi)切酶酶切后構(gòu)建到pET28a載體上，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，次日挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒委托金唯智基因公司測(cè)序。

表2 pET28a載體系列重組質(zhì)粒所用引物Table 2 The primers of pET28a series recombinant plasmids

1.4 EFE的表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，選取陽性轉(zhuǎn)化子接種至1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖瓶培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí)添加0.5 mmol/L IPTG，16 ℃、200 r/min過夜誘導(dǎo)表達(dá)。

離心收集菌體并用裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl)重懸菌體，使用高壓均質(zhì)儀破碎細(xì)胞，高速離心獲取上清液后依次使用HisTrap HP組氨酸標(biāo)記親和層析柱、HiTrapTMQ HP陰離子交換柱以及SuperdexTM200 pg分子篩層析柱純化目的蛋白并進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)，收集含高純度乙烯合成酶的目的蛋白組分，濃縮到10 mg/mL后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 EFE酶活測(cè)定

EFE酶活力單位(U)是指在特定反應(yīng)條件下每分鐘催化生成1 nmol產(chǎn)物(乙烯或P5C)所需的酶量。酶比活力是指每毫克酶蛋白具有的酶活力(U/mg蛋白)。

1.5.1 氣相色譜法測(cè)定乙烯合成活性

檢測(cè)反應(yīng)體系[7]為1 mL，組成成分為40 mmol/L Hepes pH 7.5，0.4 mmol/L L-ascorbic acid，0.5 mmol/L 2-OG, 0.5 mmol/LL-Arg, 0.2 mmol/L (NH4)2Fe(SO4)2，10 μg/mL EFE蛋白。室溫密閉反應(yīng)3 min后，使用氣密針抽取1 mL氣體手動(dòng)上樣檢測(cè)。所用氣相色譜儀是Agilent 7890B，色譜柱為HP-Plot Q柱，規(guī)格為30 m×530 μm×40 μm，氫焰離子檢測(cè)器，柱箱溫度為32 ℃±1 ℃。依據(jù)乙烯濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線定量所檢測(cè)到的乙烯生成量。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，最后結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

根據(jù)乙烯濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，將乙烯吸收峰面積換算成乙烯生成量。乙烯合成比活力為乙烯的量(nmol)/[3 min×蛋白量(0.01 mg)]。

1.5.2 茚三酮顯色法測(cè)定P5C合成活性

P5C可由茚三酮顯色法進(jìn)行測(cè)定[19-20]，反應(yīng)體系與測(cè)定乙烯產(chǎn)量體系相同。加入HCl終止反應(yīng)，然后加入250 μL茚三酮，100 °C水浴15 min，室溫冷卻，離心棄除上清液，保留紅色沉淀，加入50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0以及1 mL 47.5%乙醇后重懸均勻，在UV620nm條件下檢測(cè)吸光值，確定P5C產(chǎn)量,計(jì)算P5C合成活性。

1.6 NpEFE酶學(xué)性質(zhì)表征

選用檸檬酸鈉(pH 4.0、4.5、5.0和5.5)、MES(pH 6.0、6.5)、HEPES(pH 7.0、7.5和8.0)、Tris-HCl(pH 8.5和9.0)不同pH緩沖液測(cè)定NpEFE的乙烯合成酶酶活力，確定酶催化反應(yīng)最適pH條件。酶活測(cè)定方法和比活力計(jì)算方法與上述乙烯合成酶活性測(cè)定方法相同。

測(cè)定NpEFE穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)，保持α-酮戊二酸和精氨酸兩種底物中的一種底物濃度恒定在500 μmol/L,而改變另外一種底物濃度(0～640 μmol/L)，其余測(cè)活體系組成成分與氣相色譜測(cè)活反應(yīng)體系相同。根據(jù)已經(jīng)建立的乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線定量乙烯產(chǎn)量，利用Graphpad Prism 7.0軟件中的底物抑制動(dòng)力學(xué)模型對(duì)初速度數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EFE蛋白的表達(dá)純化與酶活測(cè)定

將各種efe基因構(gòu)建到pET28a載體后提取質(zhì)粒，測(cè)序得到質(zhì)粒序列，經(jīng)比對(duì)，與設(shè)計(jì)序列完全一致。在大腸桿菌BL21(DE3)中成功實(shí)現(xiàn)了PsEFE、RsEFE、NpEFE、PdEFE、CpEFE以及NcEFE的異源表達(dá)并獲得可溶性蛋白。將純化后的上述6種蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖1)，每種EFE蛋白純度高并且蛋白分子質(zhì)量與其理論值一致，產(chǎn)量均為10 mg左右。

圖1 各個(gè)種屬EFE的SDS-PAGE檢測(cè)分析Figure 1 SDS-PAGE analysis of EFEs

用氣相色譜法測(cè)定上述6種乙烯合成酶催化產(chǎn)生的乙烯產(chǎn)量并計(jì)算比活力，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)(表3)，NpEFE酶活性明顯高于PsEFE，為6種乙烯合成酶中活性最高的酶，因此，選擇NpEFE作后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)研究。

表3 不同種屬EFE酶的乙烯合成活性Table 3 The ethylene forming activities of different EFEs

2.2NpEFE酶學(xué)性質(zhì)表征

2.2.1NpEFE催化反應(yīng)最適pH條件

在pH 4.0～5.5條件下，NpEFE活性受到抑制，酶比活力為零。隨著pH值升高，酶比活力逐步提高。在pH 7.5時(shí)，NpEFE酶比活力達(dá)到最高，為(730.7±56.9) U/mg。當(dāng)pH值繼續(xù)升高，酶比活力逐步降低，在pH 9.0時(shí)，NpEFE仍有活性，但酶比活力僅為最高狀態(tài)時(shí)的40%(圖 2)。因此，NpEFE催化反應(yīng)最適pH值為7.5。

圖2 pH值對(duì)NpEFE催化活性的影響Figure 2 Effects of pH values on the enzymatic activity of NpEFE

2.2.2NpEFE動(dòng)力學(xué)特征

保持α-酮戊二酸和精氨酸兩種底物中的一種底物濃度恒定在500 μmol/L而改變另外一種底物濃度(0～640 μmol/L)，根據(jù)產(chǎn)物乙烯產(chǎn)量或者P5C產(chǎn)量測(cè)定乙烯合成酶在不同底物濃度下的酶活，通過Graphpad Prism 7.0軟件中的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)初速度數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析(圖3)，計(jì)算得出了NpEFE和PsEFE對(duì)于兩種底物α-酮戊二酸和精氨酸的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表4)。 利用軟件自帶的方程擬合得到Km和Vmax值，kcat值由Vmax/酶的濃度計(jì)算得到。

表4 NpEFE和PsEFE對(duì)于底物α-酮戊二酸和精氨酸的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 NpEFE and PsEFE kinetic parameters for the substrates of 2-OG and L-Arg

NpEFE在不同濃度α-酮戊二酸下的乙烯生成活性和不同濃度L-精氨酸下的P5C生成活性均符合經(jīng)典的酶催化反應(yīng)。因此，在用Graphpad Prism 7.0軟件分析時(shí)，采用標(biāo)準(zhǔn)的Michaelis-Menten方程擬合[圖3 (a)和(c)]。在不同L-精氨酸濃度下，NpEFE的乙烯生成反應(yīng)曲線則表現(xiàn)出較弱的底物抑制作用。因此，采用底物抑制動(dòng)力學(xué)模型對(duì)其進(jìn)行擬合[圖3 (b)]。PsEFE在不同濃度α-酮戊二酸和不同濃度L-精氨酸下的乙烯生成反應(yīng)曲線都表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用，采用底物抑制動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合[圖3(a)和(b)]。

(a)NpEFE與PsEFE在底物α-酮戊二酸不同濃度下催化生成乙烯的酶活性曲線；(b)NpEFE與PsEFE在底物L(fēng)-精氨酸不同濃度下催化生成乙烯的酶活性曲線；(c)NpEFE與PsEFE在底物L(fēng)-精氨酸不同濃度下催化生成P5C的酶活性曲線。圖3 NpEFE與PsEFE的酶活性曲線Figure 3 Enzymatic activity les of NpEFE and PsEFE

3 討論

本研究通過多種微生物乙烯合成酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)純化和活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)來源于藍(lán)莓枝枯病菌Neofusicoccumparvum的乙烯合成酶NpEFE具有較高活性，并系統(tǒng)測(cè)定了NpEFE的酶學(xué)性質(zhì)，包括其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及反應(yīng)最適pH值。目前已知活性最高的乙烯合成酶是來源于丁香假單胞菌的PsEFE，文獻(xiàn)報(bào)道其乙烯合成比酶活為(548±30) U/mg[11,21]。在我們實(shí)驗(yàn)室條件下測(cè)定的PsEFE比酶活為(487.2±35.2) U/mg，與文獻(xiàn)報(bào)道值相當(dāng)。相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定的NpEFE和PsEFE的活性和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明NpEFE的活性明顯高于PsEFE。PsEFE對(duì)α-酮戊二酸和L-精氨酸均表現(xiàn)出明顯的底物抑制作用，而NpEFE對(duì)α-酮戊二酸沒有表現(xiàn)出底物抑制作用，高濃度的L-精氨酸僅略微降低了NpEFE的活性。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?00 μmol/L時(shí)，NpEFE酶活性要高于PsEFE酶活性。當(dāng)?shù)孜餄舛冗M(jìn)一步提高到大于600 μmol/L時(shí)，NpEFE酶活性幾乎是PsEFE酶活性的2倍。另一方面，在高濃度底物條件下，NpEFE催化生成副產(chǎn)物P5C的活性與PsEFE幾乎相同，也說明NpEFE產(chǎn)生的副產(chǎn)物比例更低。目前已有很多關(guān)于將PsEFE應(yīng)用到工業(yè)菌株藍(lán)藻中產(chǎn)生乙烯的研究并取得了一定進(jìn)展[13-16]，但乙烯產(chǎn)量仍然偏低，其中乙烯合成酶的活性、底物抑制效應(yīng)和副產(chǎn)物是重要的制約因素。因此，對(duì)未來生物乙烯的工業(yè)化生產(chǎn)而言，來源于Neofusicoccumparvum的NpEFE表現(xiàn)出更加優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，具有更大的應(yīng)用潛力。

目前，已有晶體學(xué)研究闡明了α-酮戊二酸和L-精氨酸這兩種底物與PsEFE的結(jié)合方式[17，22]。NpEFE與PsEFE氨基酸序列比對(duì)一致性結(jié)果為52.0%。有趣的是，在兩個(gè)種屬的乙烯合成酶中，參與底物結(jié)合的殘基都是相同的。因此，可能是其他位置的結(jié)構(gòu)變化，特別是底物進(jìn)出通道的大小和極性對(duì)催化反應(yīng)速率、底物抑制和正副反應(yīng)選擇中發(fā)揮了作用。目前有關(guān)乙烯合成酶的催化機(jī)制只來源于有關(guān)PsEFE的研究，且尚有較大爭(zhēng)議[17,22]，底物進(jìn)出通道也未得到合理的揭示。NpEFE的發(fā)現(xiàn)及其性質(zhì)鑒定為進(jìn)一步闡明EFE的作用機(jī)制提供了新的研究視角。

致謝：感謝中國科學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)研究所技術(shù)支撐中心顧芮萌和張潔在氣相色譜和蛋白純化方面的幫助。