司雅楠，劉秀霞，楊艷坤，詹錦玲，白仲虎

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122;2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122;3. 江南大學 生物工程學院，無錫 214122)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，能催化酚類和芳香類化合物的氧化，使之生成相應的苯醌，同時伴隨著電子的轉(zhuǎn)移，將分子氧還原成水。其底物為單酚、二元酚、多酚類、甲氧基取代的酚類和芳香二胺等，此外也能與非酚類化合物反應[1]。催化底物的廣譜性使得漆酶具有較高的生物技術應用潛力以及工業(yè)應用價值。目前漆酶已相繼應用在紡織工業(yè)、造紙工業(yè)、環(huán)境保護、生物修復、新能源開發(fā)等眾多領域[2-4]。在對已經(jīng)功能鑒定的漆酶蛋白進行一級結構分析時，發(fā)現(xiàn)4個銅離子結合位點的氨基酸序列高度保守，分別是HXH、HXH、HX2HXH和HXHX3HX(X代表任何一種氨基酸殘基)。4個銅離子中包括Ⅰ型銅離子1個(單電子受體，具有順磁性，在λ610nm處有特征吸收峰)；Ⅱ型銅離子1個(單電子受體并具有順磁性，無特征吸收峰)；Ⅲ型銅離子2個(雙電子受體，具有反磁性，在λ330nm處有寬的特征吸收峰[5])。這些銅離子是漆酶發(fā)揮催化作用的重要輔基。在漆酶與底物進行反應時(圖1)，底物被Ⅰ型銅離子氧化，并將電子通過His-Cys-His三肽傳遞給Ⅱ型銅離子和Ⅲ型銅離子組成的三核中心，在三核中心處氧分子被還原成水。隨著對漆酶研究的不斷深入，其晶體結構也被解析出來。它是由3個杯狀結構域組成，每個結構域都具有1個β-桶裝結構。Ⅰ型銅離子位于結構域3，Ⅱ型銅離子和Ⅲ型銅離子組成的三核中心處于結構域1和3之間[6]。

圖1 底物/氧/銅離子的電子轉(zhuǎn)移過程Figure 1 Substrates/oxygen/copper ions electronic transfer pathway of laccase

在自然界中漆酶種類繁多，分布廣泛，但其生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量較低，供不應求。鑒定克隆新的漆酶基因，開發(fā)高產(chǎn)量高活性的漆酶已經(jīng)成為研究熱點。目前已有大量的細菌漆酶基因被克隆出來，如大腸桿菌的CueO、枯草芽孢桿菌的CotA、谷氨酸棒狀桿菌的CgL1、丁香假單胞菌的CopA等[7-10]。同來源于真核生物的漆酶相比，細菌漆酶具有基因克隆方便、熱穩(wěn)定性好、酶活pH值廣泛、無糖基化修飾等優(yōu)點[11]。這些優(yōu)點可以使細菌漆酶彌補傳統(tǒng)漆酶的不足，應用到真菌漆酶不適用的地方，擴大漆酶的應用范圍。

研究用PCR技術從谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組中擴增得到一個1 542 bp的DNA片段，經(jīng)過NCBI的BLAST分析發(fā)現(xiàn)其編碼漆酶的可能性。將這個基因在大腸桿菌中進行重組表達，同時研究了重組漆酶的酶學性質(zhì)，為后續(xù)細菌漆酶的開發(fā)與應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

大腸桿菌BL21、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、表達載體pCold Ⅱ在本實驗室保藏。實驗中所用的引物見表1，引物的合成和后續(xù)的測序均由蘇州金唯智公司負責。

表1 本實驗所用的引物

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

在37 ℃下用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌,在30 ℃下用LBB(LB+1%腦心浸出液)培養(yǎng)基培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌，轉(zhuǎn)速均為220 r/min。氨芐抗生素在大腸桿菌中的使用終濃度為34 mg/L。

1.1.3 酶和試劑

Hind Ⅲ、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher Scientific)；Primer STAR Max Premix高保真DNA聚合酶(TaKaRa)；EsTaqMasterMix聚合酶(康為世紀生物科技)；ligation連接酶(TaKaRa)；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(AXYGEN)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(AXYGEN)、膠回收試劑盒(AXYGEN)；細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)；細菌總RNA提取試劑盒(ThermoFisherScientific)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；2，2′-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，丁香醛連氮(SGZ)，2，6-二 甲 氧 基 苯 酚(DMP)為Aladdin公司產(chǎn)品；HRP-anti 6×His抗體(proteintech)。

1.1.4 主要耗材和儀器

PCR儀LongGene A300(朗基科儀)；實時熒光定量PCR儀StepOnePlus(Applied Biosystem)超聲波細胞破碎儀VCX800(SONICS)；臺式高速冷凍離心機Sorvall ST16R(Thermo)；紫外可見光分光光度計759S(上海棱光技術)；蛋白純化儀KTA purifier UPC10(GE Healthcare)；超濾管(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

實驗所用到的基因序列從美國國立生物技術信息中心 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得；BLAST被用于序列比對；軟件MEGA 7.0用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成

實驗采用Trizol 法提取待測樣品的總RNA，具體操作過程參考總RNA提取試劑盒的說明書。RNA的質(zhì)量通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，濃度由Q5000進行測定。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將待測樣品的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，RNA濃度稀釋為1 000 ng/μL。

1.2.3 qRT-PCR法分析轉(zhuǎn)錄水平

使用Vazyme的ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR反應，反應體系為10 μL：Master Mix (2×) 5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，樣品cDNA 1 μL，RNase Free ddH2O 3.2 μL，加樣時要保持低溫且避光。擴增機器為ABI StepOnePlus Real-Time PCR System，qPCR反應程序參照文獻[12]。以谷氨酸棒桿菌中篩選到的穩(wěn)定內(nèi)參基因NCgl2772為內(nèi)參基因，采用StepOne Software自帶的2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

1.2.4NCgl0908基因的擴增

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組DNA。利用引物pColdⅡ-NCgl0908-F/R對基因組進行PCR擴增，得到帶有Hind Ⅲ和XbaI接頭的NCgl0908基因。

1.2.5 重組表達載體的構建

PCR擴增產(chǎn)物和表達載體pColdⅡ經(jīng)過Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切后膠回收純化，然后用Ligation連接酶16 ℃連接2 h，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，在含氨芐抗生素的LB平板上篩選陽性克隆，并將陽性克隆提取質(zhì)粒后送到蘇州金唯智公司進行測序。

1.2.6 目的蛋白誘導表達及純化

在15 ℃，220 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)BL21-pColdⅡ空載菌，BL21-pColdⅡ-NCgl0908重組菌至OD600為0.5時，加入誘導劑IPTG(終濃度為24 μg/mL)后繼續(xù)培養(yǎng)20 h，誘導目的蛋白的表達。將誘導后的菌液在4 ℃，5 000 r/min的條件下離心10 min后，棄去上清液，用PBS清洗3次，加入30 mL的蛋白純化上樣緩沖液(NaCl 8 g/L, KCl 0.2 g/L, Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L, KH2PO40.27 g/L, 20 mmol/L 咪唑, pH 7.4)重懸菌體。置于冰上預冷后進行超聲破碎，35%的功率，破碎時間1 s，間隔時間2 s，破碎時間25 min。破碎完成后5 000 r/min離心10 min收集上清液。用0.22 μm針頭式濾器將上清液進行過濾并置于冰上作為待純化的樣品。

純化時先用已抽濾并脫氣的超純水對整個系統(tǒng)進行沖洗，接上蛋白純化鎳柱后，繼續(xù)用水沖洗10個柱體積，以除去蛋白純化柱中殘留的20%乙醇，用蛋白上樣緩沖液平衡柱，將待純化的蛋白樣品以0.5 mL/min的流速進行進樣，進樣后繼續(xù)用5個柱體積的蛋白上樣緩沖液平衡柱以洗脫雜蛋白，再用洗脫緩沖液(NaCl 8 g/L, KCl 0.2 g/L, Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L, KH2PO40.27 g/L, 500 mmol/L 咪唑, pH 7.4)進行梯度洗脫，收集洗脫峰。采用 SDS-PAGE以及 Western Blot檢驗純化結果。將具有目標蛋白的洗脫峰用超濾管進行濃縮和緩沖液替換(用PBS緩沖液進行多次替換，除去純化樣品中的咪唑，以防影響后續(xù)實驗結果)。

1.2.7 漆酶活性的鑒定

實驗采用ABTS作為底物檢測漆酶活性：將3 mL的待測樣品反應液(2 700 μL HAc-NaAc buffer, 200 μL ABTS, 100 μL 純化后樣品)在室溫下放置30 min后檢測反應液在3 min內(nèi)420 nm下的OD值變化[13]。把經(jīng)過15 min沸水浴去除酶活性的純化蛋白作為對照組。

1.2.8 米氏常數(shù)的測定

米氏方程指一個酶促反應的起始速度(V)與底物濃度(S)關系的速度方程：V=Vmax·S/(Km+S)，米氏常數(shù)由酶的特性決定，Km和Vmax的測定主要采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[14]。加入不同濃度的底物ABTS(15～500 μL)，420 nm處按照1.2.6的方法分別測定酶活，計算得到Vmax和Km。

2 結果與分析

2.1 NCgl0908基因的生物信息學分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，NCgl0908基因注釋為多銅氧化酶，全長1 542 bp，編碼513個氨基酸，其分子質(zhì)量理論計算值為56 ku左右。將NCgl0908基因序列在NCBI上進行BLAST分析，選擇相似度較高的細菌和真菌漆酶采用MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹,見圖2(a)。結果表明其與大腸桿菌的漆酶基因CueO具有高度的同源性。此外將它們的4個銅離子結合位點進行比對，發(fā)現(xiàn)這些結構域高度保守，分別為HXH、HXH、HX2HXH和HXHX3HX,見圖2(b)。基于以上生物信息學分析，推測NCgl0908基因是谷氨酸棒桿菌中一個未被鑒定的漆酶基因。

圖2 NCgl0908和部分細菌、真菌漆酶基因進化樹及保守結構域分析 Figure 2 Evolutionary tree and conserved domain analysis of NCgl0908 and some bacteria and fungal laccase genes

2.2 不同底物誘導后NCgl0908基因表達模式分析

為了從轉(zhuǎn)錄水平上驗證生物信息學分析的結論，將谷氨酸棒桿菌以1%的接種量接種到3瓶分別含有ABTS、SGZ、DMP的LBB液體培養(yǎng)基中，加入等體積ddH2O的LBB培養(yǎng)基作為對照，4瓶培養(yǎng)基在搖床中培養(yǎng)到對數(shù)期后分別取樣提取樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA后通過qRT-PCR方法檢測NCgl0908基因的轉(zhuǎn)錄水平，結果(圖3)顯示NCgl0908在存在底物的情況下其mRNA水平顯著提高。在ABTS的存在下，NCg10908轉(zhuǎn)錄水平被上調(diào)了5.76倍，在DMP的存在下被上調(diào)了2.40倍，在SGZ的存在下被上調(diào)了4.37倍。盡管它們都是漆酶的底物，但相同的酶對不同的底物具有不同的親和力。因此，這些底物對NCgl0908的誘導表達程度略有不同。

圖3 NCgl0908基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測Figure 3 Detection of NCgl0908 gene transcription level

2.3 NCgl0908基因的克隆、表達及純化

以谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組擴增NCgl0908基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖電泳檢測大小約為1.5 kb，與預期大小相符。將目的基因片段與帶有His標簽的pColdⅡ載體經(jīng)酶切酶連構成NCgl0908表達載體。將經(jīng)菌落PCR、酶切驗證[圖4(a)]以及測序正確的表達載體轉(zhuǎn)化到表達宿主大腸桿菌BL21中。經(jīng)IPTG誘導目的蛋白表達后，利用鎳柱親和層析法將待純化樣品進行純化。純化結果如圖4(b)所示，重組漆酶的SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)單一條帶且無其他雜蛋白，表明重組漆酶純化效果較好，且與軟件預測的大小一致。經(jīng)Western Blot分析表明[圖4(c)]，重組漆酶可以特異性地與HRP-anti 6×His抗體發(fā)生反應。

(a)1為pColdⅡ空載體；2、3為NCgl0908表達載體。(b)和(c)1為含有pColdⅡ空載體的大腸桿菌BL21；2為樣品原液；3為純化后樣品。圖4 表達載體酶切驗證結果及蛋白純化結果Figure 4 Expression vector digestion verification result and the protein purification

2.4 重組漆酶的活性檢測

1：蛋白+底物；2：底物；3：失活后蛋白+底物。圖5 純化的NCgl0908蛋白與漆酶底物ABTS的活性檢測Figure 5 Activity detection of purified NCgl0908 protein and laccase substrate ABTS

2.5 重組漆酶動力學常數(shù)測定

為了測定NCgl0908漆酶的米氏常數(shù)，以6種濃度梯度的ABTS作為底物，加入相同NCgl0908漆酶進行酶促反應，具體反應體系如表2所示。以ABTS底物濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標，以1/V為縱坐標，得到NCgl0908漆酶的雙倒數(shù)曲線如圖6所示，經(jīng)米氏方程計算，得出其米氏常數(shù)Km=2.22×10-4mol/L，最大反應速率Vmax=2.432×10-6mol/(L·min)。

表2 酶促反應體系

圖6 NCgl0908漆酶與漆酶底物ABTS的雙倒數(shù)作圖Figure 6 Plot of NCgl0908 laccase with ABTS as substrate

3 討論與結論

早期漆酶被認為只存在于真核生物中，但隨著基因組學的不斷發(fā)展與完善，人們根據(jù)已知的真核生物中漆酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了第一個來源于生脂固氮螺菌的細菌漆酶[15]。隨后，基因組學的快速發(fā)展以及生物信息學技術的進步使得數(shù)據(jù)庫中積累了越來越多的被注釋的細菌漆酶基因[16]。但迄今為止，細菌漆酶的可用工具箱還很有限，工業(yè)生產(chǎn)應用中還是以真菌漆酶為主。

谷氨酸棒桿菌因其在工業(yè)生產(chǎn)中的諸多優(yōu)點被廣泛應用于氨基酸和有機酸的生產(chǎn)，同時還具有高附加值外源蛋白的表達宿主。先前Ricklefs等[17]從谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的細菌漆酶CgL1,該酶不僅具有漆酶活性，還顯示出亞銅氧化酶活性。這使得CgL1成為生物技術應用的潛在候選者。研究發(fā)現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌中的又一個漆酶基因。從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中克隆了一個多銅氧化酶基因NCgl0908，并實現(xiàn)其在大腸桿菌中的可溶性表達。目的蛋白經(jīng)純化后，其漆酶活性以及動力學參數(shù)也經(jīng)過了實驗的測定。與其他細菌漆酶相比，該酶在大腸桿菌中的可溶性表達量較高，可達56 mg/L；而漆酶CgL1在大腸桿菌中的可溶性表達量為35 mg/L[17]；鏈霉菌漆酶SsL1在大腸桿菌中的可溶性表達量為40 mg/L[18]。但其對漆酶底物ABTS的催化效率并不高，如假單胞菌漆酶MMB-1的Km值為1.84×10-3mol/L，克雷伯氏菌漆酶Klebsiellasp.601的Km值為5.63×10-3mol/L[19]。雖然NCgl0908漆酶基因離實際的工業(yè)應用還有很大的距離，但該研究擴展了可用細菌漆酶的工具箱，并為后續(xù)細菌漆酶研究和開發(fā)提供了有利的參考和理論支持。此外，對于研究中的一些不利因素，我們可以在后續(xù)的實驗中進行改善。如重組漆酶的活性不高，來源于栓菌屬的漆酶LacD在畢赤酵母中表達后其活性可達到83 U/mL[20]。后續(xù)可以通過表達條件的優(yōu)化或更換表達系統(tǒng)來進行活性的提高；對于其酶學性質(zhì)和催化效率，也可通過定點突變和定性進化等方式進一步提高。