陳彬彬 萬(wàn)海方

慢性?xún)?nèi)臟痛是臨床上慢性疼痛中最常見(jiàn)的疾病之一[1]。抑郁癥和焦慮癥是由多因素引起的常見(jiàn)的神經(jīng)精神類(lèi)疾病，其中抑郁癥有著顯著持久的情緒低落、低自尊、社交退縮等特點(diǎn)；而焦慮癥是在面對(duì)威脅或壓力時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)烈、過(guò)度和持續(xù)的恐懼感，同時(shí)出現(xiàn)焦慮和抑郁癥狀比單獨(dú)出現(xiàn)更為常見(jiàn)[2]。大量文獻(xiàn)報(bào)道，早期生命受到不良刺激的應(yīng)激，如家庭破裂、毒素暴露、營(yíng)養(yǎng)不良等，與成年后表現(xiàn)出的內(nèi)臟痛敏及精神行為改變癥狀有著緊密關(guān)聯(lián)[3]。而目前對(duì)此的治療效果不甚理想，嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量，因此有效分析這種內(nèi)臟痛敏的變化規(guī)律及焦慮抑郁樣行為特征，對(duì)提高治療效果顯得尤為必要。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用成年清潔級(jí)C57BL/6 小鼠45只，其中15 只雄鼠和30 只雌鼠，購(gòu)自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK（蘇）2015-0030]，適應(yīng)1 周后給予分籠，每籠放置1 只雄鼠和2 只雌鼠，待雌鼠懷孕后進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，所產(chǎn)仔鼠則為實(shí)驗(yàn)所需的新生鼠，待小鼠21 天斷奶，并與母鼠分籠飼養(yǎng)；30 天區(qū)分雌雄且分籠飼養(yǎng)至成年后，選用雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共選用小鼠180 只，其中母嬰分離（MS）和非母嬰分離（NMS）小鼠各90 只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)處理標(biāo)準(zhǔn)條例。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 小鼠結(jié)直腸擴(kuò)張氣囊自制；BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟；高架十字迷宮和曠場(chǎng)箱均購(gòu)自上海軟隆。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M MS 組小鼠從出生后第2 天開(kāi)始，每天上、下午各與母鼠分離3h（9：00-12：00 和14：00-17：00），分離期間仔鼠被轉(zhuǎn)移到有潔凈墊料和加熱毯的飼養(yǎng)籠中，持續(xù)14 天；NMS 組小鼠不予任何處理。按小鼠不同年齡分為青年組（3 月齡）、中年組（10 月齡）和老年組（18 月齡），分別進(jìn)行腹外斜肌放電和內(nèi)臟痛閾水平測(cè)定實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)中各組分別取小鼠16 只，其中NMS 小鼠和MS 小鼠各8只，研究NMS 小鼠和MS 分離小鼠隨著年齡增長(zhǎng)內(nèi)臟痛敏的變化規(guī)律。將3 月齡成年小鼠束縛于50mL離心管（整個(gè)管身燙制多處出氣孔）中2h，建立急性束縛應(yīng)激模型，實(shí)驗(yàn)分為NMS+急性束縛應(yīng)激組（NMS+R）、MS+急性束縛應(yīng)激組（MS+R），分別進(jìn)行高架十字迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)中各組分別取小鼠8 只，研究小鼠焦慮樣行為變化。取NMS 小鼠和MS 小鼠各10 只，進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)，研究小鼠抑郁樣行為變化。

1.4 腹外斜肌放電實(shí)驗(yàn) 首先將小鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，七氟烷麻醉后，將自制的且涂抹石蠟油的小鼠結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal distension，CRD）氣囊插入肛門(mén)內(nèi)2cm，外導(dǎo)管固定后分別連接注射器和血壓計(jì)，并將銀絲雙極電極插入一側(cè)距中線1.5cm 的腹股溝韌帶上方的腹外斜肌上，待小鼠完全清醒后分別給予20、40、60、80mmHg（1mmHg=0.133kPa）CRD 壓力梯度刺激，每次加壓持續(xù)10s，間隔至少4min。BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄不同擴(kuò)張壓力刺激下小鼠腹外斜肌放電波幅變化。

1.5 內(nèi)臟痛閾水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前12h 禁食不禁水，七氟烷麻醉后，按上述方法置入擴(kuò)張氣囊，肛門(mén)外導(dǎo)管用膠布固定于小鼠尾根部，再經(jīng)三通分別與注射器和血壓計(jì)連接，待小鼠完全清醒后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。通過(guò)注射器持續(xù)、緩慢加壓，當(dāng)觀察到小鼠下腹壁明顯抬離箱底或收縮變平時(shí)立即停止加壓，記錄此時(shí)血壓計(jì)上顯示的壓力值，擴(kuò)張壓力范圍在10～80mmHg 之間，重復(fù)3 次，取平均值作為小鼠內(nèi)臟痛閾值。

1.6 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 將小鼠背對(duì)實(shí)驗(yàn)人員，置于距離地面40cm 的高架十字迷宮中央部，頭朝開(kāi)放臂（長(zhǎng)30cm，寬6cm），攝像機(jī)記錄6min 內(nèi)小鼠累積進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)和開(kāi)放臂時(shí)間的百分比。

1.7 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 選用不反光的淺色曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱（50cm×50cm×50cm），將底部分為16 小格，其中中間4 小格定義為中間區(qū)域，將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)的中心區(qū)域，計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)記錄6min 內(nèi)小鼠中間區(qū)域停留時(shí)間和實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)總移動(dòng)距離。

1.8 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 小鼠單籠飼養(yǎng)，給予1%蔗糖水和自來(lái)水各1 瓶，兩瓶水置于同一高度，并定期交換位置，適應(yīng)48h；禁食禁水24h 后，與適應(yīng)期類(lèi)似方法，同時(shí)給予小鼠事先已稱(chēng)重的1%蔗糖水和自來(lái)水各1 瓶，2h 后取走水瓶，并對(duì)水瓶再次進(jìn)行稱(chēng)重，得出每只小鼠糖水偏好百分比＝蔗糖水消耗量/（蔗糖水＋自來(lái)水消耗量）×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩組比較采用t 檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Bonferroni 方法進(jìn)行兩兩比較；各組間比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析（two-way repeated measures ANOVA），P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生期母嬰分離引起不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛敏的差異

2.1.1 不同CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅變化 與NMS 相比，MS 青年組分別在20、40、60mmHg 及中年組20、40mmHg CRD 壓力刺激下，腹外斜肌放電波幅顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而老年組20、40、60 及80mmHg CRD 壓力刺激下CRD 壓力刺激下MS 小鼠腹外斜肌放電波幅均無(wú)顯著改變（P＞0.05）。見(jiàn)表1-4。

表1 20mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表1 20mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴(kuò)張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表2 40mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表2 40mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴(kuò)張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離小鼠；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表3 60mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表3 60mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴(kuò)張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aaP＜0.01

表4 80mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表4 80mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴(kuò)張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa

2.1.2 不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛閾水平變化 與NMS相比，青年組與中年組MS 小鼠內(nèi)臟痛閾顯著降低（P＜0.05），而老年組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛閾水平比較（mmHg，）

表5 不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛閾水平比較（mmHg，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aP＜0.05

2.2 新生期母嬰分離引起成年小鼠焦慮抑郁樣行為表現(xiàn)

2.2.1 新生期母嬰分離引起小鼠成年后焦慮樣行為表現(xiàn) 在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，與NMS 組比較，MS組小鼠開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂時(shí)間的百分比均顯著減少（P＜0.01）；NMS 和MS 組小鼠分別給予急性束縛應(yīng)激后，與NMS 組小鼠比較，NMS+R 組小鼠開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂時(shí)間百分比減少（P＜0.05）；與NMS+R 組比較，MS+R 小鼠開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂時(shí)間百分比均進(jìn)一步顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與NMS組相比較，MS 組小鼠中心區(qū)域停留時(shí)間和曠場(chǎng)中移動(dòng)總距離均顯著減少（P＜0.01)；NMS+R 組小鼠曠場(chǎng)中移動(dòng)總距離顯著減少（P＜0.05）；與NMS+R 組比較，MS+R 組小鼠中心區(qū)域停留時(shí)間和曠場(chǎng)移動(dòng)總距離顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），表現(xiàn)出顯著的焦慮樣行為。見(jiàn)表6。

表6 四組小鼠在高架十字迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)比較（）

表6 四組小鼠在高架十字迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)比較（）

注：NMS 為非母嬰分離小鼠，NMS+R 為非母嬰分離小鼠給予急性束縛應(yīng)激；MS 為母嬰分離小鼠；MS+R 為母嬰分離小鼠給予急性束縛應(yīng)激；與NMS 組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與NMS+R 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

2.2.2 新生期母嬰分離引起成年小鼠抑郁樣行為表現(xiàn) 與NMS 比較，MS 組小鼠的糖水消耗百分比顯著降低（P＜0.05），表現(xiàn)出明顯快感缺失的抑郁樣行為。見(jiàn)表7。

表7 兩組小鼠糖水消耗百分比比較（%，）

表7 兩組小鼠糖水消耗百分比比較（%，）

注：NMS 為非母嬰分離小鼠；MS 為母嬰分離小鼠；與NMS 組比較，aP＜0.05

3 討論

新生期是大腦快速生長(zhǎng)，神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，在此期間遭受不良刺激，腦內(nèi)相關(guān)神經(jīng)元的可塑性、突觸功能、膠質(zhì)細(xì)胞活化及分泌的炎癥因子水平可發(fā)生改變[4]，常常引起成年后多種行為表型的異常，其中慢性?xún)?nèi)臟痛覺(jué)高敏和精神行為改變是目前研究的熱點(diǎn)[5-6]。

母嬰分離是目前廣泛使用的早期生命應(yīng)激模型之一。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)建立母嬰分離模型來(lái)模擬人類(lèi)早期經(jīng)歷的生活逆境，并采用腹外斜肌放電和痛閾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)手段得出小鼠成年后不同年齡段內(nèi)臟痛覺(jué)高敏的變化規(guī)律；進(jìn)一步采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠成年后焦慮抑郁樣行為特征內(nèi)容，多方式驗(yàn)證早期生命應(yīng)激對(duì)小鼠成年后誘發(fā)的內(nèi)臟痛敏癥狀和精神改變產(chǎn)生的影響。

有研究指出，母嬰分離致小鼠成年后腸道敏感性增加和焦慮抑郁樣表現(xiàn)中，雌性小鼠較為易感[7]，這也與臨床中女性患者內(nèi)臟痛敏和焦慮抑郁癥的發(fā)病率較高相吻合，因此本次研究用雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[8-9]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)生命早期給予母嬰分離不良刺激，導(dǎo)致小鼠成年后發(fā)生內(nèi)臟痛覺(jué)高敏現(xiàn)象，這與以往的研究結(jié)果相一致[10]；而隨著小鼠年齡增加，這種內(nèi)臟痛敏癥狀可得到自然緩解，直至老年后基本消失。在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中可知生命早期經(jīng)歷母嬰分離至成年后小鼠開(kāi)臂的次數(shù)和時(shí)間均減少，產(chǎn)生焦慮樣行為，此時(shí)再次給予急性束縛應(yīng)激來(lái)模擬成年后人類(lèi)受到來(lái)自生理或心理的壓力，表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的焦慮樣行為；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)作為研究動(dòng)物自主運(yùn)動(dòng)能力、新異環(huán)境探索欲望、焦慮及抑郁等情緒障礙經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，MS 組小鼠在移動(dòng)總距離和中央格停留時(shí)間均減少，再次受到束縛應(yīng)激后也表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的情緒障礙[11]。糖水偏好實(shí)驗(yàn)中顯示，新生期母嬰分離小鼠成年后有明顯的快感缺失，表現(xiàn)出顯著的抑郁樣行為改變，這與Gill 等[12]的研究結(jié)果相一致。這提示生命早期經(jīng)歷不良刺激，成年后可誘發(fā)嚴(yán)重的焦慮抑郁樣行為，且抗壓應(yīng)激能力也得到很大程度的削弱。

自然環(huán)境下母鼠對(duì)幼鼠舔舐、梳理皮毛等的精心照料，使其腎上腺皮質(zhì)功能處于低反應(yīng)狀態(tài)，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸對(duì)外界刺激所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)功能降低，這給幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育及成熟提供良好的條件，形成天然的抗壓抗應(yīng)激能力[13]。而在母嬰分離過(guò)程中，HPA 軸處于高反應(yīng)狀態(tài)，且這一效應(yīng)可持續(xù)至成年，有研究表明HPA 軸異?；罨瘏⑴c促進(jìn)了新生期結(jié)直腸擴(kuò)張應(yīng)激致慢性?xún)?nèi)臟痛過(guò)程[14]；同時(shí)這對(duì)幼鼠神經(jīng)元發(fā)育也產(chǎn)生不同程度的損害，誘發(fā)幼鼠成年后焦慮抑郁樣表現(xiàn)[15]。

綜上所述，新生期母嬰分離是一個(gè)有效誘發(fā)小鼠成年后內(nèi)臟痛敏和焦慮抑郁樣行為的模型，所誘發(fā)的內(nèi)臟痛敏癥狀可隨著年齡增加而逐漸緩解，且對(duì)急性束縛應(yīng)激的焦慮調(diào)節(jié)能力明顯降低，這將為深入研究生命早期應(yīng)激引起的內(nèi)臟痛敏癥狀和焦慮抑郁樣行為的基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。