王貴紅，左 婷，李 然，左正才

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽安慶 246000)

痛風(fēng)是血尿酸升高、尿酸鹽(monosodium urate，MSU)結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)中引起關(guān)節(jié)腫痛的炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，發(fā)作時(shí)患者會(huì)出現(xiàn)劇烈疼痛，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。近30年來(lái)我國(guó)高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生率急劇升高[1]，目前我國(guó)痛風(fēng)患病率為1%～3%，且逐年上升，痛風(fēng)已成為嚴(yán)重危害人們身體健康的常見(jiàn)疾病。國(guó)內(nèi)外對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時(shí)的治療主要是使用非甾體抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素[2]，臨床中長(zhǎng)期痛風(fēng)的患者常合并腎功能不全、代謝性疾病、消化道潰瘍等，隨著我國(guó)人口老齡化加劇，老年痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者越來(lái)越多，但上述三種藥物的使用卻受到限制。

瑞巴派特(rebamipide)作為一種治療消化道潰瘍、急慢性胃炎、急性加重期胃黏膜病變的藥物，已于臨床應(yīng)用20余年，安全性、耐受性良好。體外研究表明，胃黏膜保護(hù)劑瑞巴派特可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激與Caspase-1抑制尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β的產(chǎn)生[3]。以往研究顯示，瑞巴派特通過(guò)抑制炎癥因子、氧化應(yīng)激等機(jī)制，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎[4]和干燥綜合征[5]等炎癥性疾病有治療作用，但對(duì)于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎這種細(xì)胞因子在發(fā)病機(jī)制中起重要作用的炎癥性疾病，瑞巴派特的作用尚不明確，本研究的目的是通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討瑞巴派特在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

42只雄性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠體質(zhì)量(240±20) g。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，大鼠在中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物房中進(jìn)行5～7 d的馴化，溫度25 ℃，濕度50%，12 h光暗交替周期。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有大鼠均喂食標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重和標(biāo)記，使用Excel軟件創(chuàng)建隨機(jī)表，42只大鼠按隨機(jī)表法分為3組，每組14只。A組為口服瑞巴派特，B組為口服秋水仙堿，C組為口服安慰劑(生理鹽水)。瑞巴派特的劑量為每日200 mg/kg，以生理鹽水配制成9 mL溶液，每隔8 h灌胃3 mL。秋水仙堿的劑量為每日1 mg/kg，以生理鹽水配制成6 mL溶液，分兩次灌胃。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模6 h前，三組分別以各自相應(yīng)藥物3 mL灌胃一次，造模后，A組每隔8 h以瑞巴派特溶液3 mL灌胃一次，B組每隔8 h灌胃一次，第一次與第三次給予秋水仙堿溶液3 mL，第二次給予生理鹽水3 mL，C組每隔8 h以生理鹽水3 mL灌胃一次。

1.3 制備大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型

將MSU晶體(Sigma，St.Louis，MO，USA)混合在10%(體積分?jǐn)?shù))Tween-80溶液中，0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水，10%(體積分?jǐn)?shù))氯仿麻醉下，用1 mL注射器抽吸50 μL(內(nèi)含5 mg MSU)以針尖45°注入大鼠右踝關(guān)節(jié)。觀察0、6、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)大鼠踝關(guān)節(jié)的臨床表現(xiàn)，分別于0、48、72 h每組各處死2只大鼠，于24 h時(shí)每組處死8只大鼠。用毛細(xì)采血管眼眶靜脈穿刺采集血樣，室溫下凝結(jié)30 min，10 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到1.5 mL微量離心管中，-80 ℃保存。

1.4 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的評(píng)估

通過(guò)臨床評(píng)分或腫脹指數(shù)[使用寬條(2～3 mm)和卡尺測(cè)量右踝關(guān)節(jié)腫脹](méi)來(lái)監(jiān)測(cè)大鼠的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)情況。踝關(guān)節(jié)評(píng)分[6]：0=正常；1=踝關(guān)節(jié)輕度腫脹和發(fā)紅，可見(jiàn)體表骨性標(biāo)志，輕度跛行；2=踝關(guān)節(jié)明顯腫脹和發(fā)紅局限于踝關(guān)節(jié)，體表骨性標(biāo)志消失，明顯跛行；3=踝關(guān)節(jié)外肢體腫脹，腳完全離地，三足步態(tài)。各時(shí)間點(diǎn)于處死大鼠前觀察踝關(guān)節(jié)的臨床表現(xiàn)，測(cè)量右踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)，腫脹指數(shù)=(測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的關(guān)節(jié)周長(zhǎng)-初始周長(zhǎng))/初始周長(zhǎng)[6]。

取大鼠血清標(biāo)本，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(R&D Systems，Minnesota，USA)檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α水平。使用微板讀取器在450 nm處讀取光密度值。

1.5 組織學(xué)檢查

分離大鼠踝關(guān)節(jié)，以10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣過(guò)夜，從矢狀面切開(kāi)，石蠟包埋，制成2 μm切片，蘇木精-伊紅染色。采用手動(dòng)計(jì)數(shù)計(jì)算中性粒細(xì)胞的滑膜浸潤(rùn)，并使用5分量表進(jìn)行評(píng)估[7]：0=正常，1=最小浸潤(rùn)，2=輕度浸潤(rùn)，3=中度浸潤(rùn)，4=強(qiáng)浸潤(rùn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MSU誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床和組織學(xué)表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)良好，24 h時(shí)，C組剩余12只大鼠中有3只未出現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎，造模成功率75%。C組的臨床評(píng)分12 h高于6 h，24 h達(dá)到最大值，48和72 h持續(xù)下降，腫脹指數(shù)在24 h達(dá)到峰值，后逐漸下降，到72 h基本恢復(fù)正常(圖1)。A組和B組的臨床評(píng)分和腫脹指數(shù)隨時(shí)間推移未見(jiàn)顯著變化(圖2)。

圖1 尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作大鼠模型Figure 1 Rat model of acute gout arthritis induced by monosodium urate crystals

圖2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型誘導(dǎo)后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的臨床評(píng)分和腫脹指數(shù)Figure 2 Clinical score and swelling index of the three rat groups at the five time points after model induced

造模24 h時(shí)，C組的臨床評(píng)分[2 (1～3)]明顯高于A組[0 (0～1)]和B組[1 (0～2)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)；C組的腫脹指數(shù)[0.36 (0.16～0.52)]也明顯高于A組[0.11 (0～0.20)]和B組[0.12 (0～0.16)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

造模24 h時(shí)，C組滑膜組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[5分量表評(píng)分為4 (2～4)]，A組[1 (0～2)]與B組[1 (0～2)]未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。C組的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)估明顯高于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001, 表1)。

圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)踝關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)(HE ×400)Figure 3 The infiltration of inflammatory cells in ankle joint synovium at the different time points of the three rat groups (HE ×400)

2.2 三組大鼠血清炎癥因子的變化

C組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平呈先升高后下降的趨勢(shì)，A組和B組各因子的水平無(wú)明顯變化規(guī)律(圖4)。

造模24 h后，C組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平明顯高于A組和B組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

表1 造模24 h后三組大鼠血清細(xì)胞因子、臨床表現(xiàn)、組織學(xué)變化的比較Table 1 Comparison of serum cytokines, clinical manifestations and histological changes in three rat groups at 24 h after modeling

IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor.圖4 造模后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)三組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的變化Figure 4 Changes of serum IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α levels in three rat groups at the 4 time points after induced by MSU crystals

3 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時(shí)，沉積的MSU晶體可誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)滲入關(guān)節(jié)滑膜，伴有劇烈的紅腫熱痛和血管通透性增加[8]，癥狀在發(fā)病12～24 h內(nèi)達(dá)高峰，通常在1～2周內(nèi)緩解[9]。既往的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型研究顯示，通過(guò)大鼠右踝關(guān)節(jié)注射MSU后成功誘導(dǎo)了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作[4]。本研究中觀察到安慰劑對(duì)照組大鼠右踝關(guān)節(jié)注射MSU后的臨床表現(xiàn)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與痛風(fēng)患者急性發(fā)作的表現(xiàn)一致，炎癥反應(yīng)在造模后24 h前后最為明顯，表明本研究使用MUS晶體成功誘導(dǎo)了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作為一種炎癥性疾病，細(xì)胞因子在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用，目前認(rèn)為，IL-1β是誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要細(xì)胞因子，甚至有研究提出急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是IL-1β炎性疾病的原型[10]。Caspase-1可以激活促炎細(xì)胞因子IL-1和IL-8，在一種膠原蛋白實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中，Caspase-1抑制劑抑制了IL-1β的產(chǎn)生，改善了疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程[11]。氧化應(yīng)激是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的另一重要因素，有研究表明，抑制活性氧生產(chǎn)和減少氧化應(yīng)激可以預(yù)防和緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作[12]。

瑞巴派特的主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)前列腺素合成、激活生長(zhǎng)因子、抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥[13]，同時(shí)通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子的激活，抑制IL-1β、TNF-α和IL-8的產(chǎn)生[14-15]。一項(xiàng)使用瑞巴派特治療環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱炎的動(dòng)物模型研究顯示，瑞巴派特抑制了大鼠體內(nèi)的髓過(guò)氧化物酶、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[16]。一項(xiàng)小鼠骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的研究也顯示，瑞巴派特下調(diào)了IL-1β、TNF-α和NF-κB等的mRNA表達(dá)[17]。人類細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)中，瑞巴派特通過(guò)抑制Caspase-1與氧化應(yīng)激，有效抑制了由MSU晶體介導(dǎo)的IL-1β的激活和釋放[3]。既往研究結(jié)果提示，瑞巴派特可能具有預(yù)防痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在安慰劑組中，MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，于造模后24 h達(dá)到高峰，而瑞巴派特組和秋水仙堿組大鼠血清中各因子水平隨時(shí)間推移無(wú)明顯變化，與安慰劑組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，瑞巴派特組和秋水仙堿組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示瑞巴派特和秋水仙堿均可抑制MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的產(chǎn)生，瑞巴派特抑制炎癥因子產(chǎn)生的效果與秋水仙堿相當(dāng)。

秋水仙堿是臨床廣泛使用的治療、預(yù)防痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的首選藥物之一[2]。本研究顯示，在提前給予秋水仙堿和瑞巴派特口服的大鼠組，右踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體后未觀察到明顯的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的臨床表現(xiàn)，關(guān)節(jié)組織病理也未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而在給予安慰劑對(duì)照的大鼠組，我們觀察到了典型的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的臨床過(guò)程，關(guān)節(jié)滑膜組織中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)分、腫脹指數(shù)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度等方面，安慰劑對(duì)照組都明顯高于秋水仙堿組和瑞巴派特組(P<0.01)，瑞巴派特組和秋水仙堿組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示瑞巴派特和秋水仙堿成功預(yù)防了MUS晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作，且兩者之間的療效相當(dāng)。

綜上所述，本研究通過(guò)在大鼠踝關(guān)節(jié)注射MSU晶體成功誘導(dǎo)了大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作，大鼠造模前提前給予瑞巴派特和秋水仙堿可以抑制MSU晶體誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作，同時(shí)抑制關(guān)節(jié)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。