王進　張倩　唐好知　楊旭　王花欣

摘要 目的：探討虎潛丸對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨組織的保護作用，以及通過調控堿性磷酸酶（ALP）、白細胞介素-6（IL-6）和血清骨保護素（OPG）的表達而防治骨質疏松癥的機制研究。方法：采用卵巢切除法復制絕經后骨質疏松癥大鼠模型，隨機分為模型組、虎潛丸組、雌二醇組，同時設置假手術組作為對照，各組分別給予相應的藥物灌胃。灌胃12周后取血處死，稱量各組大鼠的體質量、子宮重量;取大鼠左側股骨、脛骨進行骨密度檢測;全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中血糖、血脂、鈣磷的變化;ELISA檢測各組大鼠血清中IL-6、ALP、OPG的水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠骨密度顯著下降（P<0.05），骨微結構破壞明顯;與模型組比較，虎潛丸組大鼠骨密度增加，骨小梁的完整性升高，骨微結構得到改善，體質量增長明顯下降，血脂血糖水平降低，IL-6、ALP含量均有所降低，OPG含量升高，血鈣含量有明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：虎潛丸能夠提高去卵巢大鼠的骨量，防治絕經后骨質疏松癥，其作用機制可能與降低ALP、IL-6，提高OPG含量有關。

關鍵詞 虎潛丸;絕經后骨質疏松癥;骨密度;去卵巢大鼠;雌激素;白細胞介素-6;中醫(yī)藥治療

Study on the Protective Effect and Mechanism of Huqian Pill on Bone Tissue of Ovariectomized Osteoporosis Rats

WANG Jin1，ZHANG Qian 1，2，TANG Haozhi1，YANG Xu1，WANG Huaxin1，2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250355，China; 2 Shandong Co-Innovation Center of Classic Traditional Chinese Medicine Formula，Ji′nan 250355，China）

Abstract Objective：To explore the protective effect of Huqian Pill on bone tissue of ovariectomized osteoporosis rats and the mechanism of prevention and treatment of osteoporosis by regulating the expression of ALP，IL-6 and OPG.Methods：The model of postmenopausal osteoporosis rats was made by ovariectomy.The rats were randomly divided into a model group，a Huqian Pills group and an estradiol group.At the same time，a sham operation group was set up as a control，and each group was given corresponding drugs by gavage.After 12 weeks of gavage，blood was taken and executed，the body mass and uterus mass of each group were weighed; the bone density of left femur and tibia of each group were measured; the changes of blood glucose，blood lipid and calcium phosphorus in serum of each group were detected by automatic biochemical analyzer; the contents of IL-6，ALP and OPG in rat serum of each group were detected by ELISA.Results：Compared with sham group，model group BMD decreased significantly（P<0.05）; there was significant destruction of bone microarchitecture; compared with model group，Huqian Pill increased bone density of rats，increases the integrity of trabecular bone，bone microarchitecture was improved，the amount of weight gain decreased，blood lipid and glucose levels decreased，IL-6，and ALP content were decreased，levels of OPG elevated，calcium content significantly increased.The differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Haqian Pills can improve bone mass in ovariectomized rats，prevent postmenopausal osteoporosis，and its mechanism may reduce ALP，IL-6，and improve OPG related content.

Keywords Huqian Pills; Postmenopausal osteoporosis; Bone density; Ovariectomized rats; Estrogen; IL-6; Traditional Chinese medicine treatment

中圖分類號：R285.5;R274.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.010

絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）以骨量減少，骨微結構被破壞，骨密度降低，骨脆性增加為特征[1]。此病通常發(fā)病隱蔽，臨床癥狀出現(xiàn)較晚，以突發(fā)性骨折為主，嚴重影響著中老年婦女的健康[2]。對于女性來說，絕經后的生命時長約占其一生的三分之一，且隨著人均壽命的延長，這一時段還會不斷延長，因此提高中老年婦女絕經后骨質疏松癥患者生命質量尤為重要。據(jù)預測，到21世紀中葉，中國骨質疏松性骨折人數(shù)將達到599萬，相應的醫(yī)療支出高達1 745億元[3]，且目前醫(yī)學上沒有針對骨質疏松癥行之有效的治愈方法，因此骨質疏松癥的預防以及早期的干預治療尤為關鍵。

現(xiàn)階段西醫(yī)治療骨質疏松癥的藥物有骨基礎藥物（如鈣劑、維生素D和其衍生物等）、抗骨吸收藥物（如雌激素、選擇性雌激素受體調節(jié)劑、雙膦酸鹽類和降鈣素等）、促進骨形成藥物（如甲狀旁腺激素、胰島素生長因子-1和骨硬化素抗體等）以及雙重藥理作用藥物（如雷尼酸鍶）等，但均有不同程度的不良反應[4]。而中藥以及中成藥治療骨質疏松癥以其療效明顯、不良反應少的優(yōu)勢，受到了越來越多的關注[5]。虎潛丸出自《丹溪心法》，原方由黃柏、龜甲、知母、熟地黃、陳皮、白芍、鎖陽、虎骨、干姜組成，為滋陰降火，益精填髓，強筋健骨的名方，主治肝腎虧虛，精血不足，筋骨痿弱?；撏钁门R床治療絕經后骨質疏松癥效果顯著，但具體機制未明確[6-7]。

本實驗采用卵巢切除法（OVX），構建大鼠骨質疏松癥模型，然后分組觀察虎潛丸的療效。通過觀察大鼠體質量、子宮形態(tài)、血糖血脂、鈣磷、骨密度及骨微結構的情況，并檢測大鼠血清堿性磷酸酶（ALP）、IL-6、血清骨保護素（OPG）的水平，探討虎潛丸對骨質疏松癥的療效機制，為中藥復方治療骨質疏松癥的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠32只，雌性，9月齡，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物中心有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。于SPF級動物房進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h明暗循環(huán)，自由飲水。

1.1.2 藥物 虎潛丸由酒炒黃柏、酒炙龜甲、酒炒知母、熟地黃、陳皮、白芍、鎖陽、炙狗骨（替代虎骨）、干姜9味中藥組成（藥材購于山東中醫(yī)藥大學新中魯醫(yī)院，經山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定為合格產品）。

1.1.3 試劑與儀器 戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：621B2）;0.9%氯化鈉注射液（山東科倫藥業(yè)有限公司，批號：B180301002）;異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號：217180501）;4%多聚甲醛固定液（Biosharp，批號：BL539A）;ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A059-2）;IL-6、OPG ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：E-EL-R0015c;E-EL-R0050c）。小動物氣體麻醉機（Matrx公司，美國，型號：VIP3000）;高速冷凍離心機（中國賽默飛世爾科技有限公司，型號：Multifuge X1R）;全自動生化分析儀（桂林優(yōu)利特電子集團有限公司，型號：URIT-8036）;酶標儀（伯騰儀器有限公司，美國，型號：VT05404-0998）;離活體一體化Micro-CT設備—NEMO（平生醫(yī)療科技有限公司，型號：Super Nova Micro CT）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表的方法將大鼠分為假手術組8只和手術組24只。將手術組大鼠行雙側卵巢摘除術。具體操作步驟：使用小動物麻醉機對大鼠進行麻醉，麻醉成功后，大鼠俯臥位，固定四肢，備皮消毒。觸摸找到肋骨后緣，距離雙側肋后緣中點下1.5 cm及正中線兩側1.5 cm處，分別取2個長約1 cm的縱切口。依次切開皮膚、皮下組織、腹膜，暴露腹腔臟器;先找到一側的Y形子宮，順著子宮向遠端探查，可找到梅花狀的卵巢。結扎卵巢下端輸卵管，完整地摘除雙側卵巢，摘除卵巢塊經過切片鏡下鑒定為卵巢。逐層縫合傷口，傷口滴加青霉素注射液以防感染。再進行另一側操作。假手術組在暴露卵巢后，不予切除，在其附近切除與卵巢體積大小相近的脂肪組織，余操作均與手術組相同。術后連續(xù)3 d肌內注射青霉素G 20萬單位/只以預防感染。術后7 d將手術組大鼠隨機分為模型組、虎潛丸組與雌二醇組，每組8只。本實驗經山東中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審核，符合實驗動物與動物實驗福利、倫理要求（倫理審批號：SDUTCM2018112901）。

1.2.2 給藥方法 造模后1周，根據(jù)人和動物藥物等效劑量換算公式，以成人臨床用藥劑量計算動物用藥劑量[8]。參考元代朱震亨的《丹溪心法》中虎潛丸用量，黃柏（酒炒）18 g、狗骨（酒炙）15 g、龜甲（酒炙）12 g、干姜10 g，鎖陽8 g、知母（酒炒）、熟地黃、陳皮和白芍各6 g，加適量水煎。將中藥飲片水煎2次后，混合濾液并濃縮至90 mg/mL，將戊酸雌二醇片配制成10 μg/mL的混懸液。按照1 mL/100 g的灌胃劑量，分別用虎潛丸水煎液和戊酸雌二醇片混懸液灌胃;假手術組和模型組大鼠用生理鹽水灌胃;1次/d，連續(xù)灌胃12周。根據(jù)體質量調整灌胃量。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 取材及實驗指標檢測 藥物干預結束后進行實驗動物取材。各組大鼠禁食不禁水12 h后，用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血處死，血液離心，分離上清液，并置于-80 ℃冰箱中保存。取出Y形子宮用4%多聚甲醛固定，24 h后脫水石蠟包埋;取大鼠左側股骨、脛骨，剔除附著在周圍的軟組織和肌肉，固定于4%多聚甲醛中備用。

1.2.3.2 體質量及子宮系數(shù) 大鼠造模后1周后連續(xù)給藥3個月，每周稱重并記錄體質量。藥物干預結束后取材后稱取子宮重量。子宮系數(shù)=子宮重量/體質量。

1.2.3.3 骨密度檢測及三維成像 取大鼠股骨，用Micro-CT進行掃描，利用自帶軟件進行股骨近端骨密度測定。利用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行骨組織形態(tài)學計量分析，包括骨小梁數(shù)量、骨小梁面積等。

1.2.3.4 血生化檢測 將大鼠麻醉，經腹主動脈取血，將全血以3 000 r/min的轉速，13.5 cm的離心半徑，在4 ℃下離心15 min分離血清。生化儀檢測血清中血脂、血糖、鈣、磷的水平。

1.2.3.5 ELISA法檢測血清中堿性磷酸酶（ALP）、白細胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）、人成骨細胞骨保護素（Osteoprorotegerin，OPG）的含量 將凍存血清按試劑盒操作步驟檢測ALP、IL-6、OPG的含量。設置酶標儀吸光度A為450 nm，以標準品濃度為橫坐標，A為縱坐標做標準曲線，計算各樣品對應的濃度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布者用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 虎潛丸對去卵巢大鼠體質量和子宮系數(shù)的影響 1）與假手術組比較，模型組體質量增加最多（P<0.01），而虎潛丸組和雌二醇組體質量增長比模型組低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。2）與假手術組比較，模型組子宮系數(shù)明顯減小。差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。3）與模型組比較，虎潛丸組和雌二醇組子宮系數(shù)均有增長趨勢。見表1。

2.2 虎潛丸對于去卵巢大鼠子宮形態(tài)的影響 假手術組大鼠子宮內膜組織輪廓清晰，血管豐富，腺體數(shù)量多。與假手術組比較，模型組大鼠子宮宮腔干癟變形且內膜厚度明顯變薄，柱狀上皮細胞萎縮，胞質減少，固有層、肌層與漿膜層組織輪廓模糊，血管減少，腺體相對萎縮減少。與模型組比較，虎潛丸組與雌二醇組子宮宮腔相對豐滿，固有層、肌層與漿膜層組織輪廓較為完整，血管較為豐富，宮腔萎縮情況略有改善，腺體數(shù)量較模型組多。見圖1。

2.3 虎潛丸對去卵巢大鼠骨密度及骨微結構的影響 與假手術組比較，模型組大鼠的股骨骨密度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，虎潛丸組和雌二醇組骨密度均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表2。

從股骨三維成像圖可見，假手術組大鼠骨小梁大小適中，骨小梁排列整齊且連接度好;模型組大鼠股骨骨小梁變短變小，稀疏，斷裂，呈骨質疏松狀。與假手術組比較，模型組骨小梁數(shù)目、厚度以及小梁面積均明顯降低;與模型組比較，虎潛丸組和雌二醇組骨小梁數(shù)目、厚度以及小梁面積均明顯上升，骨小梁結構完整。見圖2。

2.4 虎潛丸對去卵巢大鼠血脂和血糖的影響 與假手術組比較，模型組的血糖、三酰甘油（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total Cholesterol，TC）顯著上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）;與模型組比較，虎潛丸組和雌二醇組大鼠的血糖、TG和TC均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表3。

2.5 虎潛丸對去卵巢大鼠血清中鈣、磷的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清中的鈣、磷水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，虎潛丸組和雌二醇組鈣水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

2.6 虎潛丸對去卵巢大鼠血清中ALP、OPG及IL-6的影響 與假手術組比較，模型組的ALP及IL-6水平明顯升高，而OPG水平則顯著下降（P<0.01）;比較于模型組，虎潛丸組大鼠ALP及IL-6水平明顯下降，而OPG水平則明顯上升（P<0.05）。見表5。

3 討論

隨著我國老齡化程度不斷提高，骨質疏松癥發(fā)病率明顯上升。其中絕經后骨質疏松癥是最常見的骨質疏松癥類型。女性絕經后卵巢功能衰退，雌激素分泌不足，導致骨代謝紊亂，骨吸收大于骨重建，進而發(fā)展為骨質疏松癥[9]。中醫(yī)學將PMOP列為“骨痿、骨枯、骨痹”的范疇，《素問·痿論》就有記載：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！逼洳∥辉诠?，與腎肝關系密切，其主要病機是腎精虧虛，腎失滋養(yǎng)。中醫(yī)學理論認為“肝主筋，主藏血，主疏泄”，在體合筋，連接骨節(jié)，與肢體運動緊密相連，氣血衰少，血不養(yǎng)筋，則易發(fā)骨質疏松[10]。故治療以益精填髓，滋養(yǎng)肝腎為主。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在防治PMOP方面具有很大的優(yōu)勢，能夠提高患者骨密度，減少骨折發(fā)生率，并且療效顯著，不良反應小[5]。現(xiàn)代藥理學證明，龜甲可能通過降低骨轉換有效改善激素性骨質疏松[11]。鎖陽中的有效成分具有清除自由基、抗氧化、增強免疫功能等作用，能夠作用于股骨頭壞死中的成骨細胞[12]。

虎潛丸出自《丹溪心法》，是經典的補腎名方。有滋陰降火，益精填髓，強筋健骨的功效，主治肝腎虧虛，精血不足，筋骨痿弱。方中黃柏、龜甲、知母、熟地黃養(yǎng)血滋陰，益精補腎;陳皮、白芍、鎖陽、虎骨（現(xiàn)用狗骨代替）、干姜益精填髓，理氣和中，使補而不滯。諸藥合用，充養(yǎng)精血，益精填髓，強筋健骨?，F(xiàn)代藥理研究證明，虎潛丸具有促進骨髓間充質干細胞（BMSC）增殖的作用，并且可以促進其向成骨細胞分化，對于骨質疏松癥有較好的療效[13]。

Kim等[14]研究表明，肥胖對骨質疏松癥具有保護作用，能夠增加骨骼負荷，使成骨細胞功能代償性增強。Saunier等[15]的研究表明，長期雌激素缺乏會增加肥胖風險。王艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過降低脂蛋白脂肪酶，誘導激素敏感性脂肪酶的活性以及通過增加腎上腺素的脂解作用來抑制脂肪形成，促進脂肪的分解。Kalinich等[17]研究表明雌激素可以直接通過影響下丘腦來影響攝食。絕經后的女性雌激素分泌不足也多有肥胖的表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為體質量的上升以及血清TG、TC的升高以及血糖的異常。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠摘除卵巢后，模型組的體質量較假手術組明顯升高，血清中血糖、TG、TC明顯上升，經過雌二醇和虎潛丸治療的大鼠體質量增長量以及血清中血糖、TG、TC含量明顯下降。研究結果顯示，大鼠切除卵巢后，雌激素分泌減少，進而加劇了肥胖，體質量上升。這與Saunier等[15]的研究相吻合。

血清鈣、磷含量的變化是反映全身骨質代謝情況的重要指標。血清中的鈣、磷含量可以間接反映骨骼中的礦物質變化情況[18]。實驗發(fā)現(xiàn)模型組血鈣含量、血磷含量較假手術組均有降低，經過虎潛丸和雌激素治療后，血鈣含量有明顯上升。原因可能是破骨細胞分化活躍，鈣、磷離子流失加重，導致了血鈣、血磷含量降低。

骨免疫在絕經后骨質疏松癥的發(fā)病機制中起著關鍵作用，在活化的T淋巴細胞能夠產生促炎細胞因子，其中就包括IL-6，IL-6起著破骨細胞增殖和分化的雙重角色[19]。IL-6也是破骨細胞活性的主要介質，能夠激活骨吸收[20]，這是由于IL-6可以通過多種作用途徑，增加破骨細胞形成，并提高其活性，延長破骨細胞的壽命，抑制破骨細胞的凋亡，最終促進骨吸收，導致骨質疏松癥的發(fā)生[21]。人成骨細胞骨保護素（Osteoprorotegerin，OPG）屬于腫瘤壞死因子受體家族中的一員，OPG的主要功能是抑制破骨細胞的形成、分化，促進成熟破骨細胞的凋亡[22]。Bucay等[23]的實驗顯示，OPG基因敲除小鼠破骨細胞數(shù)量明顯增多，并伴有嚴重的骨質疏松。ALP在人體細胞膜分布廣泛。李海等[24]的研究顯示，在骨質疏松發(fā)生時，破骨細胞功能增強，骨質流失增多，代償性引起成骨細胞的功能增強，機體分泌ALP增多。Zhao等[25]的研究顯示，ALP在腎臟中近曲小管的細胞表面分布廣泛，當骨質疏松發(fā)生時，機體尤其是腎臟與骨的ALP流失入血，血液中的ALP含量因此升高。在本實驗中，模型組相較于假手術組IL-6、ALP含量升高，OPG含量下降。經過虎潛丸和雌激素治療后，IL-6、ALP含量均有所降低，OPG含量升高，虎潛丸可能影響了ALP、IL-6、OPG的表達。

通過切除大鼠雙側卵巢來復制絕經后婦女骨質疏松癥模型是目前公認的造模方法[26]，故本研究以此建立絕經后婦女骨質疏松癥模型。骨密度檢測結果顯示，模型組大鼠骨密度顯著低于假手術組，很好地模擬了絕經后骨質疏松癥[27]。同時研究結果表明，虎潛丸可能通過影響ALP、IL-6、OPG的表達，促進成骨細胞的發(fā)育以及抑制破骨細胞的分化成熟，可以有效地減緩因雌激素缺乏導致的骨質疏松癥。因此，臨床上使用虎潛丸治療絕經后婦女骨質疏松癥是一種安全有效的方法，具有良好的臨床推廣價值。

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（2020-07-08收稿 責任編輯：蒼寧）

基金項目：國家自然科學基金委員會青年科學基金項目（82004087）;山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（2017-004）;山東省高等學?？萍加媱濏椖浚↗18KA271）;山東省自然科學基金重大基礎研究項目（ZR2019ZD23）;國家級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201910441010）;山東中醫(yī)藥大學青年創(chuàng)新團隊項目

作者簡介：王進（1997.11—），男，本科生在讀，研究方向：骨質疏松癥研究，E-mail：wangjinsrt@qq.com

通信作者：王花欣（1984.02—），女，博士，副教授，研究方向：骨病及分子機制研究，E-mail：whx215@163.com