余毅 張婷 熊逸嘯 向振 歐廣洋 潘波 劉劍 徐儀昕 劉雅娟 李梅琪 余望貽

〔摘要〕 目的 研究活血化瘀法對膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs）的影響。方法 將32只新西蘭兔分為對照組、模型組、中藥組、陽性藥組，每組8只。采用改良Hulth造模法建立兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，給予藥物治療28 d。中藥組給予活血化瘀合劑（1.4 g/kg），陽性藥組給予硫酸氨基葡萄糖溶液（0.07 mg/kg），對照組及模型組給予等體積蒸餾水。給藥結(jié)束后，取兔右后膝關(guān)節(jié)軟骨行HE染色，用于組織病理分析;收集關(guān)節(jié)液，采用ELISA法檢測MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量;采用Western blot和RT-qPCR法分別檢測兔關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白及mRNA水平。結(jié)果 與對照組比較，模型組兔關(guān)節(jié)軟骨存在淺表層纖維化，軟骨細胞成簇、排列無規(guī)則、部分壞死，滑膜增厚，基質(zhì)染色丟失等病理現(xiàn)象，關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量較對照組顯著升高（P<0.01），其蛋白及mRNA表達在關(guān)節(jié)軟骨中也顯著上升（P<0.01）;與模型組比較，中藥組兔關(guān)節(jié)軟骨病理損傷得以緩解，關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量明顯下降（P<0.01或P<0.05），關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9蛋白及mRNA表達均下調(diào)（P<0.01），MMP-13 mRNA表達下調(diào)（P<0.05）;與中藥組比較，陽性藥組MMP-13 mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 活血化瘀法能緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨的損傷，其機制可能與抑制MMPs的表達，尤其是MMP-3和MMP-9表達有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 膝骨性關(guān)節(jié)炎;活血化瘀;基質(zhì)金屬蛋白酶;關(guān)節(jié)軟骨;關(guān)節(jié)液

〔中圖分類號〕R255.6 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.005

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Huoxue Huayu method on matrix metalloproteinase （MMPs） in rabbit model of knee osteoarthritis. Methods 32 New Zealand rabbits were divided into control group， model group， Chinese medicine group and positive drug group， with 8 rats in each group. A rabbit model of knee osteoarthritis was established by modified Hulth modeling method， followed by drug treatment for 28 days. The Chinese medicine group was given Huoxue Huayu Mixture （1.4 g/kg）， the positive drug group was given glucosamine sulfate solution （0.07 mg/kg）， and the control group and the model group were given equal volume of distilled water. At the end of the administration， rabbit right posterior knee articular cartilage was taken for histopathological analysis through HE staining， and the content of MMP-3， MMP-9 and MMP-13 of synovial fluid was detected by ELISA; Western blot and RT-qPCR were used to detect MMP-3， MMP-9， MMP-13 protein and mRNA levels in rabbit articular cartilage. Results There were superficial fibrosis in the articular cartilage of rabbits in the model group compared with the control group， the chondrocytes were clustered， arranged irregularly， partially necrotic， thickened synovial， and lost in matrix staining， the content of MMP-3， MMP-9 and MMP-13 in synovial fluid was higher than control group （P<0.01）， and the protein and mRNA expression in the articular cartilage also increased significantly （P<0.01）; compared with the model group， the pathological damage of rabbit articular cartilage of Chinese medicine group was relieved， and the content of MMP-3， MMP-9 and MMP-13 in joint fluid decreased significantly （P<0.01 or P<0.05）， articular cartilage MMP-3， MMP-9 protein and mRNA expression were down-regulated （P<0.01）， and MMP-13 mRNA expression was down-regulated （P<0.05）; compared with the Chinese medicine group， MMP-13 mRNA expression in positive drug group was down-regulated （P<0.05）. Conclusion Huoxue Huayu method can alleviate the damage of articular cartilage in rabbits with knee osteoarthritis model， and its mechanism may be related to the inhibition of MMPs expression， especially the expression of MMP-3 and MMP-9.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; Huoxue Huayu; matrix metalloproteinase; articular cartilage; joint fluid

膝骨性關(guān)節(jié)炎是由于膝關(guān)節(jié)局部損傷、炎癥或慢性勞損引起的軟骨變性及活動障礙的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，在老年人中患病率高達50%[1]。軟骨組織損傷是膝骨性關(guān)節(jié)炎的重要病理特征，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs）在軟骨基質(zhì)降解過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2-3]。因而，抑制MMPs表達能保護軟骨組織，恢復(fù)膝骨關(guān)節(jié)的正常活動。膝骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，氣滯血瘀是其主要病機，治宜活血化瘀，基于此理法而成的消炎散是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，已使用40余年，全方由近20味中藥組成，具活血涼血、散瘀止痛之功，臨床療效顯著[4]。本研究選用消炎散中主要的活血化瘀中藥“當歸、赤芍、姜黃”組成活血化瘀合劑，通過建立膝骨性關(guān)節(jié)炎動物模型，明確活血化瘀法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用特點，并以MMPs為切入點，闡明其分子機制。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

32只SPF級健康新西蘭兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心代購，使用許可證號為SKYK（湘）2019-0009。

1.2 ?實驗藥物

活血化瘀合劑藥物組成：當歸10 g，赤芍10 g，姜黃10 g，原藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。全方煎煮2次，第1次加10倍量水、第2次加8倍量水，每次煎煮1.5 h，合并水煎液，濃縮至終質(zhì)量濃度為含生藥量1.3 g/mL，保存?zhèn)溆?。硫酸氨基葡萄糖（伊索佳）購自新興同仁藥業(yè)有限公司，批號：18092602，規(guī)格：0.25 g×12粒，國藥準字號H20041317。

1.3 ?主要試劑與儀器

MMP-3、MMP-9、MMP-13 ELISA試劑盒（批號：CSB-E09269Rb、CSB-E06933Rb、CSB-E14220Rb，武漢華美生物工程有限公司）;MMP-3、MMP-9、MMP-13一抗（批號：14351S、13667S、69926S，美國CST中國分公司）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：740703，日本Takara有限公司）;蘇木精、伊紅（批號：ZLI-3301、ZLI-9613，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

RM223切片機、DMi1倒置光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）;MK3酶標儀（美國Themo中國有限公司）;CFX96熒光定量PCR儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad生物科技有限公司）。

1.4 ?動物分組、造模與給藥

將32只新西蘭兔隨機分為對照組、模型組、中藥組、陽性藥組，每組8只。除對照組外，均采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型[5]。耳緣靜脈注射20%的烏拉坦（4 mL/kg）麻醉兔，固定，取右側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)，常規(guī)脫毛、消毒，使膝關(guān)節(jié)屈曲，沿兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，使內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶完全離斷。經(jīng)前抽屜試驗、內(nèi)側(cè)應(yīng)力試驗驗證韌帶完全離斷后，充分沖洗創(chuàng)口，逐層縫合，術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素。對照組不切開關(guān)節(jié)囊，用鹽水沖洗后縫合。術(shù)后預(yù)防感染。造模后4周隨機挑選3只動物進行X線片檢查，X線下見兔右膝關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)面呈高密度影、關(guān)節(jié)周圍骨贅形成，提示造模成功[5]。造模成功后開始灌胃給藥，給藥量按照70 kg成人與1.5 kg兔體表面積等效換算（成人劑量×70 kg×0.07/1.5 g/kg）。中藥組給予臨床等效劑量的活血化瘀合劑（1.4 g/kg），陽性藥組給予臨床等效劑量的硫酸氨基葡萄糖溶液（0.07 g/kg），對照組及模型組給予等體積蒸餾水，均持續(xù)給藥28 d。

1.5 ?動物處理

實驗過程中共有5只動物死亡，其中模型組2只，中藥組2只，陽性藥組1只。末次給藥完成后，采用空氣栓塞法處死動物，取右后膝后髕上囊處常規(guī)脫毛，作長約0.5 cm的縱形切口，用1 mL生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔3次后，收集關(guān)節(jié)液，而后切除右后膝關(guān)節(jié)軟骨，切斷軟骨，一半置于4%多聚甲醛中固定，一半保存于液氮中。

1.6 ?HE染色觀察兔關(guān)節(jié)軟骨病理損傷情況

取固定的兔關(guān)節(jié)軟骨，常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、水化后進行HE染色，脫水、透明、封片，裝盒待用。于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，分析病理損傷情況，并在光鏡下對切片進行Mankin評分[6]，Mankin評分用來評價軟骨組織病理變化程度，包含對軟骨結(jié)構(gòu)（0～6分）、軟骨細胞（0～3分）、基質(zhì)染色（0～3分）、潮線（0～1分）等方面的觀察判定，評分越高，提示軟骨受損程度越嚴重。每個樣本取3次評分的平均值。

1.7 ?ELISA檢測兔關(guān)節(jié)液MMPs含量

收集關(guān)節(jié)液后，于4 ℃、4 000 ?r/min條件下離心10 min（離心半徑6 cm），取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書的詳細步驟進行實驗操作，檢測右膝關(guān)節(jié)液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。

1.8 ?Western blot檢測兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMPs蛋白表達水平

取兔關(guān)節(jié)軟骨組織，勻漿，測定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白變性，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，裁剪條帶，加入稀釋后的一抗（按1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。洗滌條帶，加入二抗室溫下孵育4 h，洗滌條帶，化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Image J成像軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白的相對表達水平。

1.9 ?RT-qPCR檢測兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMPs mRNA表達水平

取兔關(guān)節(jié)軟骨組織，加入Trizol試劑，勻漿，提取組織總RNA，并進行含量檢測。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進行PCR反應(yīng)擴增目的基因，擴增條件為：95 ℃ 15 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 30 s退火延伸，35個循環(huán)，以β-actin基因為內(nèi)參。引物由深圳華大基因公司合成，序列見表1。

1.10 ?統(tǒng)計學(xué)分析

所有的實驗數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，方差齊者采用單因素方差分析，多重比較用LSD檢驗，方差不齊時用TambaneS T2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組兔關(guān)節(jié)軟骨HE染色情況

對照組兔關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰，表面光滑，細胞排列整齊，基質(zhì)染色基本均勻;模型組軟骨淺表層纖維化，軟骨細胞成簇、排列無規(guī)則、部分壞死，滑膜增厚，基質(zhì)染色丟失;中藥組及陽性藥組關(guān)節(jié)軟骨表層偶見少量簇集的軟骨細胞，無細胞壞死，滑膜稍微增厚，基質(zhì)染色尚可。Mankin評分結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組、中藥組、陽性藥組兔軟骨組織評分均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，中藥組及陽性藥組評分顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;中藥組與陽性藥組比較，評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、表2。

2.2 ?各組兔關(guān)節(jié)液MMPs含量比較

與對照組比較，模型組、中藥組及陽性藥組關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，中藥組及陽性藥組關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;中藥組與陽性藥組比較，MMP-3、MMP-9、MMP-13含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.3 ?各組兔關(guān)節(jié)軟骨MMPs蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組及陽性藥組關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平均顯著升高，中藥組MMP-3、MMP-13表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，中藥組MMP-3、MMP-9表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），MMP-13降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，陽性藥組MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;中藥組與陽性藥組比較，MMP-3、MMP-9、MMP-13表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2、表4。

2.4 ?各組兔關(guān)節(jié)軟骨MMPs mRNA表達水平比較

與對照組比較，模型組、中藥組及陽性藥組關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，中藥組及陽性藥組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;與中藥組比較，陽性藥組MMP-13 mRNA表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，與“痹病”“骨痹”類似，是由于風(fēng)、寒、濕邪獨立或合而入侵致經(jīng)絡(luò)閉阻、氣血不通而發(fā)生?！端貑枴け哉摗吩疲骸帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！痹摬《喟l(fā)于中老年人群，是由于其長期勞損、氣血不足，累及筋骨關(guān)節(jié)，致氣血不和、瘀血內(nèi)生、阻塞經(jīng)絡(luò)、瘀熱互結(jié)，故而成痹。清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》中明確提出“痹有瘀血”，提示可用活血化瘀法治療痹證。課題組前期運用活血化瘀法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎已取得良好的療效，以當歸、赤芍、姜黃為主要活血化瘀藥物的消炎散治療瘀阻脈絡(luò)、氣滯血瘀型關(guān)節(jié)炎療效尤為明顯[7]。當歸、赤芍是臨床常用的活血補血藥對，當歸味甘而重，氣輕而辛，專補血行血，為血中氣藥，又通經(jīng)活絡(luò)，常用于治療瘀血腫痛、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等;赤芍苦而微寒，善清熱涼血、散瘀止痛，主治瘀滯經(jīng)閉、脅痛、跌撲損傷;姜黃可破血行氣、通經(jīng)止痛，常用于跌打損傷。臨床與基礎(chǔ)研究均證實，活血化瘀合劑對膝骨關(guān)節(jié)炎有良好的治療效果[8-9]。

膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵病理特征之一是軟骨細胞的大量降解，而關(guān)節(jié)軟骨主要由細胞外基質(zhì)組成，抑制基質(zhì)降解和軟骨細胞凋亡被認為是治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵[10]。MMPs是基質(zhì)合成和降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其過量表達會加速軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖的分解，并促進軟骨細胞凋亡，誘發(fā)疾病的發(fā)生[11]。MMP-9是與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生聯(lián)系最為緊密的MMPs亞型，其含量的異常升高與其組織金屬蛋白酶抑制劑水平的相對下降與骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨退變過程密切相關(guān)[12];同時，MMP-3和MMP-13表達的異常在膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[13]。此外，MMP-1、MMP-7等亞型也被報道參與了膝骨疾病的發(fā)生[14-15]。由此可見，MMPs多種亞型均參與了關(guān)節(jié)軟骨退變過程，但MMP-3、MMP-9和MMP-13可能在疾病發(fā)生過程中扮演了更為關(guān)鍵的角色。RYU JH等[16]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在與其受體結(jié)合后會通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)酶相關(guān)通路，誘導(dǎo)軟骨組織釋放MMP-3、MMP-9及MMP-13，增加II型膠原和聚集蛋白聚糖的剪切和降解，破壞關(guān)節(jié)軟骨。

本研究中，膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨病理損傷明顯，軟骨細胞成簇肥大、排列紊亂、部分細胞凋亡甚至壞死，滑膜增厚。與對照組比較，模型組軟骨組織Mankin評分、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨中MMPs含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，中藥組及陽性藥組軟骨組織Mankin評分、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨中MMPs含量顯著下降（P<0.05或P<0.01）。硫酸氨基葡萄糖為天然的氨基單糖，是人體關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖的必需成分，臨床廣泛用于預(yù)防和治療各種類型的骨性關(guān)節(jié)炎，研究[17-18]表明，硫酸氨基葡萄糖可參與抗氧化、抗炎，并抑制MMPs、氧化自由基的形成，預(yù)防糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥對關(guān)節(jié)軟骨細胞的損害。本研究結(jié)果也證實，硫酸氨基葡萄糖能夠抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎MMPs的產(chǎn)生，保護關(guān)節(jié)軟骨細胞。

本研究結(jié)果提示，活血化瘀合劑能夠緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨的病理損傷，其機制與抑制關(guān)節(jié)液及軟骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13水平有關(guān)。本研究證實活血化瘀法能通過調(diào)控MMPs水平發(fā)揮治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的功效，一定程度闡明了活血化瘀法的療效機制，為其臨床治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供了良好的理論依據(jù)。

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