李 林 魏旭靜 路素雙 劉 晶 （河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000）

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性患者的生命和健康。子宮內(nèi)膜癌的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，普遍認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是多步驟多基因控制的復(fù)雜過程。子宮內(nèi)膜癌的侵襲遷移能力嚴(yán)重影響患者預(yù)后，探討子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后具有 重 要 意 義［1-2］。 長 鏈 非 編 碼 RNA（LncRNA）CCAT1 在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為是一種癌基因，CCAT1 在多種惡性腫瘤的侵襲遷移中也發(fā)揮重要作用［3-4］，但CCAT1參與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制復(fù)雜。MAPK/ERK 信號(hào)通路參與惡性腫瘤的侵襲遷移過程，MAPK/ERK 信號(hào)通路激活可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移［5-6］。CCAT1 是否可通過MAPK/ERK 信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲遷移尚不明確。本文對(duì)子宮內(nèi)膜癌KLE 細(xì)胞中CCAT1 的表達(dá)以及沉默CCAT1 對(duì)子宮內(nèi)膜癌侵襲遷移和MAPK/ERK信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討CCAT1在子宮內(nèi)膜癌侵襲遷移中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系KLE 和正常人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系T-HESC（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；CCAT1 siRNA（CCAT1-siRNA）和 NC siRNA（NC）（廣州博銳生物科技）；Lipofectamine 2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒、Trizol 試劑、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Sigma 公司）；胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、ERK 通路激動(dòng)劑表皮生長因子（EGF）（美國BPB公司）；兔抗人ERK 單克隆抗體、兔抗人p-ERK 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；Transwell 小室（美國Corning公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 測定 KLE 和 T-HESC 細(xì)胞中CCAT1 水平 miR Vana miRNA 法分離兩種細(xì)胞總RNA ，每組設(shè)7 個(gè)復(fù)孔，分光光度計(jì)測定RNA 濃度和純度。將分離的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR 測定兩細(xì)胞中CCAT1 水平（CCAT1 上游引物為5'-CCA TTC CAT TCA TTT CTC TTT CCT A-3'，下游引物為 5'-GGC GTA GGC GAT TGG GGA TCG-3'）。PCR 反應(yīng)條件為 95℃ 30 s；95℃ 15 s；58℃ 30 s，共40 個(gè) 循 環(huán) 。 以 U6 為 內(nèi) 參 照 。 CCAT1 水 平 以 2?ΔΔCt表示。

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期的KLE 細(xì)胞分為空白對(duì)照組（BC 組）、陰性對(duì)照組（NC 組）、CCAT1-siRNA 組和 CCAT1-siRNA+EGF 組，根據(jù) Li?pofectamine 2000 試劑盒說明轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞：取各組對(duì)數(shù)生長期的KLE細(xì)胞接種到6孔板中（5×105個(gè)/孔）培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長至90%以上融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，CCAT1-siRNA 組 轉(zhuǎn) 染 CCAT1-siRNA，CCAT1-siR?NA+EGF 組轉(zhuǎn)染CCAT1-siRNA 并加入30 ng/ml EGF 處理［7］，NC 組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 siRNA，BC 組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 測定，細(xì)胞中CCAT1水平，方法同1.2.1。

1.2.3 Transwell 測定各組KLE 細(xì)胞侵襲能力 取轉(zhuǎn)染48 h 各組KLE 細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到Transwell 小室上室（1×104個(gè)/孔），小室下室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，抽吸基質(zhì)膠去除上室孔內(nèi)細(xì)胞，并用棉簽擦拭，小室下室細(xì)胞用乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)測定各組KLE 細(xì)胞遷移能力 將各組轉(zhuǎn)染48 h KLE 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長，在6 孔板背面用0.5 mm 記號(hào)筆每隔1 cm 劃平行直線標(biāo)記，將對(duì)數(shù)生長期KLE 細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，接種到標(biāo)記好的6 孔板中，貼壁生長后，取長勢良好、密度均勻的細(xì)胞做劃痕：用20μl槍頭在細(xì)胞面垂直版面劃直線，出去劃痕部位殘留細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下測量0 h 和24 h 劃痕距離，計(jì)算細(xì)胞遷移距離（遷移距離=0 h劃痕距離?24 h劃痕距離）。

1.2.5 Western blot 測 定 各 組 KLE 細(xì) 胞 ERK 和 p-ERK 蛋白水平 取各組轉(zhuǎn)染48 h KLE 細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜后，加入BSA 封閉2 h，加入一抗（兔抗人ERK 單克隆抗體、兔抗人p-ERK 單克隆抗體）（1∶500）過夜孵育，加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，以β-actin 為內(nèi)參照。用Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度值。目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件分析，CCAT1 水平、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移距離以及E-cadh?rein、Vimentin、Snail、Twist、ERK 和 p-ERK 蛋白水平以表示，兩組采用t檢驗(yàn)，三組采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，取P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCAT1 在 KLE 細(xì)胞中的表達(dá) KLE 細(xì)胞中CCAT1 水平（1.83±0.17）高于 T-HESC 細(xì)胞（1.00±0.09）（t=11.416，P<0.001）。見圖1。

圖1 KLE和T-HESC細(xì)胞中CCAT1水平Fig.1 CCAT1 levels in KLE and T-HESC cells

2.2 CCAT1-siRNA 對(duì) KLE 細(xì)胞中 CCAT1 水平的影響 與 BC 組（1.00±0.11）和 NC 組（0.98±0.09）比較，CCAT1-siRNA 組KLE細(xì)胞中CCAT1水平（0.37±0.08）降低（F=101.237，P<0.001），BC 組和 NC 組KLE 細(xì)胞中CCAT1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 各組KLE細(xì)胞中CCAT1水平Fig.2 CCAT1 levels in KLE cells of each group

2.3 各組KLE 細(xì)胞侵襲能力比較 與BC 組和NC組比較，CCAT1-siRNA 組KLE 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)降低（P<0.05），與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+EGF 組KLE 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)升高（P<0.05），BC 組和NC 組KLE 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1和圖3。

表1 各組KLE細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移距離比較（）Tab.1 Comparison of number of invasion cells and mi?gration distance of each group of KLE cells（）

表1 各組KLE細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移距離比較（）Tab.1 Comparison of number of invasion cells and mi?gration distance of each group of KLE cells（）

Note：Compared with BC group，1）P<0.05；compared with NC group，2）P<0.05；compared with CCAT1-siRNA group，3）P<0.05.

Migration distance（mm）7.23±1.21 7.16±1.18 2.69±0.831）2）4.76±0.911）2）3）30.273<0.001 Groups BC NC CCAT1-siRNA CCAT1-siRNA+EGF F P Number of invasion cells 87.42±12.35 85.86±11.58 31.27±8.351）2）52.68±9.141）2）3）47.218<0.001

圖3 Transwell測定各組KLE細(xì)胞侵襲能力Fig.3 Transwell assay to determine invasive ability of each group of KLE cells

2.4 各組KLE 細(xì)胞遷移能力比較 與BC 組和NC組比較，CCAT1-siRNA 組KLE 細(xì)胞遷移距離降低（P<0.05），與CCAT1-siRNA 組比較，CCAT1-siRNA+EGF 組KLE 細(xì)胞遷移距離增加（P<0.05），BC 組和NC 組KLE 細(xì)胞遷移距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1和圖4。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)測定各組KLE細(xì)胞遷移能力Fig.4 Scratch test to determine migration ability of each group of KLE cells

2.5 各組KLE 細(xì)胞ERK 和p-ERK 蛋白水平比較 各組KLE 細(xì)胞ERK 蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與 BC 組和 NC 組比較，CCAT1-siRNA 組KLE細(xì)胞p-ERK蛋白水平降低（P<0.05），與CCAT1-siRNA 組 比 較 ，CCAT1-siRNA+EGF 組 KLE 細(xì) 胞 p-ERK蛋白水平升高（P<0.05），BC組和NC組KLE細(xì)胞p-ERK蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2和圖5。

表2 各組KLE細(xì)胞ERK和p-ERK蛋白水平比較（）Tab.2 Comparison of ERK and p-ERK protein levels in KLE cells of each group（）

表2 各組KLE細(xì)胞ERK和p-ERK蛋白水平比較（）Tab.2 Comparison of ERK and p-ERK protein levels in KLE cells of each group（）

Note：Compared with BC group，1）P<0.05；compared with NC group，2）P<0.05；compared with CCAT1-siRNA group，3）P<0.05.

p-ERK 0.28±0.06 0.27±0.07 0.07±0.021）2）0.18±0.031）2）3）27.238<0.001 Groups BC NC CCAT1-siRNA CCAT1-siRNA+EGF F P ERK 0.51±0.08 0.49±0.11 0.50±0.09 0.52±0.10 0.128 0.943

圖5 Western blot 測定各組 KLE 細(xì)胞 ERK 和 p-ERK 蛋白水平Fig.5 Western blot analysis to determine ERK and p-ERK protein levels in KLE cells

3 討論

CCAT1 位于轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 附近、長度為2 628 nt 的長鏈非編碼RNA，最初在結(jié)腸癌中高表達(dá)被發(fā)現(xiàn)，后來研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為是一種致癌基因，可通過與miRNA 相互作用參與靶基因的調(diào)控，從而參與惡性腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及遷移等過程，有望成為惡性腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［8］。大量研究發(fā)現(xiàn)CCAT1 參與多種惡性腫瘤的侵襲遷移過程，如CCAT1 可促進(jìn)前列腺癌、宮頸癌、乳頭狀甲狀腺癌的侵襲和遷移，可通過抑制miR-33a 預(yù)防黑素瘤細(xì)胞的侵襲，沉默CCAT1 可通過下調(diào)Bmi-1 的表達(dá)抑制胃癌的侵襲和遷移［9-13］。CCAT1 在子宮內(nèi)膜癌中的作用也受到大家關(guān)注，如YU 等［14］也發(fā)現(xiàn)CCAT1 在子宮內(nèi)膜癌組織和子宮內(nèi)膜癌KLE、Ishi?waka、HEC-1-A等細(xì)胞中高表達(dá)；潘洪麗等［15］研究發(fā)現(xiàn) HEC-1-B 和 AN3CA 細(xì)胞中 CCAT1 水平升高，沉默CCAT1 可抑制HEC-1-B 細(xì)胞的侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。但CCAT1 影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制尚不清楚。

惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移受多種信號(hào)通路的調(diào)控，MAPK 信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移的調(diào)控過程，在惡性腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育及浸潤中發(fā)揮重要作用。MAPK 有4 條信號(hào)通路，其中ERK 途徑信號(hào)通路在信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用，和人類惡性腫瘤的關(guān)系最密切［16］。p-ERK 為 ERK 的活化形式，只有活化的ERK 才具有活性。磷酸化的ERK 可影響多種癌基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)血管生成，破壞細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移，MAPK/ERK 信號(hào)通路的激活可促進(jìn)EMT 過程的進(jìn)展［17］。MAPK/ERK 信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜癌侵襲遷移的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［18］。CCAT1 可通過促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞MAPK信號(hào)通路參與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程，如CCAT1 可通過MAPK 信號(hào)通路促進(jìn)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移［19］；通過激活MAPK 信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的侵襲遷移［20］。

介于MAPK/ERK 信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜癌侵襲遷移的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，CCAT1 可通過MAPK信號(hào)通路參與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，因此推測CCAT1 可能通過MAPK/ERK 信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。本文對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE 中CCAT1 的表達(dá)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲、遷移和MAPK/ERK 信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CCAT1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中高表達(dá)，沉默CCAT1 的表達(dá)可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲遷移和MAPK/ERK信號(hào)通路，給予ERK 通路激動(dòng)劑處理后沉默CCAT1 的表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲遷移和MAPK/ERK 信號(hào)通路的抑制作用減弱，由此分析沉默CCAT1 可能通過抑制MAPK/ERK 信號(hào)通路抑制EMT 過程，從而抑制子宮內(nèi)膜癌的侵襲遷移。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌KLE 細(xì)胞中高表達(dá)CCAT1，CCAT1 可能通過抑制 MAPK/ERK 信號(hào)通路抑制EMT過程參與子宮內(nèi)膜癌的侵襲遷移。