岳芳倩 鄒有瑞 孫勝玉 王 哲 馬 輝 （寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川750004）

膠質(zhì)瘤是人腦中最常見(jiàn)原發(fā)性神經(jīng)惡性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的80%，由于其生長(zhǎng)過(guò)程中浸潤(rùn)廣泛，手術(shù)很難將其徹底切除，預(yù)后極差，病死率較高［1-3］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）是一類(lèi)具有自我更新、多向分化潛能且致瘤性極強(qiáng)的細(xì)胞亞群，近年研究表明，膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后可能與GSCs關(guān)系密切［4-5］。

膽堿激酶（choline kinase，CHK）是磷酸膽堿生物合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶類(lèi)，有膽堿激酶α（choline kinase alpha，CHKA）和膽堿激酶β（choline kinase beta，CHKB）2 個(gè)亞型［6］。在體內(nèi)，CHKB 僅具有乙醇胺激酶活性，而CHKA 兼具CHK、乙醇胺激酶雙重活性，在功能方面優(yōu)于CHKB，是膽堿激酶的優(yōu)勢(shì)亞型。近年研究顯示，CHKA 具有癌基因特性，在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的重要因子［7］。課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)CHKA 參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展過(guò)程，與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚未明確，推測(cè)其可能與GSCs聚集與活性有關(guān)。本研究擬探究CHKA在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況及其活性被抑制后GSCs 增殖、凋亡情況，初步探討CHKA 與GSCs的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人源性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG、小膠質(zhì)細(xì)胞株HMC3（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM、DMEM-F12、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、B27因子（美國(guó)Invitrogen 公司）；胰蛋白酶和青霉素、鏈霉素（上海碧云天公司）；兔抗人CHKA抗體、鼠抗人Nestin 抗體、兔抗人 CD133 抗體、兔抗人 GAPDH 抗體（美國(guó)Abcam 公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司）；CHK 抑制劑MN58b（上海一飛公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Pre?mix ExTaqTM（日本TaKaRa 公司）；凋亡試劑盒（聯(lián)科生物）；CCK8 試劑盒（日本同仁公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendrof 儀器公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及U87GSCs 提取 U87MG 細(xì)胞、HMC3 細(xì)胞 37℃ 水浴復(fù)蘇，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，鋪于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化U87MG細(xì)胞，以神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液，置于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，更換為神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，即無(wú)血清DMEM-F12 中加入20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF 及 2%B27 因子，培養(yǎng) 3~5 d，培養(yǎng)中期半換液。

1.2.2 免疫熒光法鑒定U87GSCs 收集生長(zhǎng)狀況較好的U87GSCs 腫瘤球重懸于含血清培養(yǎng)基中，在鋪有無(wú)菌蓋玻片的24 孔板中爬片4 h，棄培養(yǎng)基，PBS 緩沖液清洗 3 次，5 min/次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗，0.1%Triton100X 通透 30 min，PBS清洗 3 次，5 min/次，山羊血清封閉 30 min，加入CD133、Nestin 抗體 4℃ 孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液清洗3 次，5 min/次，加入相應(yīng)二抗，避光孵育 30 min，DAPI 染色 10 min，PBS 清洗 3 次，5 min/次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察熒光情況并拍照。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè) CHKA 表達(dá) RNA 提取試劑盒提取U87MG、HMC3、U87GSCs 細(xì)胞總RNA，測(cè)定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。CHKA F：5'-CGGAAAGTGCTCCTGCGGCT-3'，R：5'-AACCAAGCTGTGCAGCCCAA-3'，以β-actin為內(nèi)參，按照說(shuō)明書(shū)加樣體系檢測(cè)。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)CHKA 蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解法提取不同細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量，30 μg/孔上樣，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳（80 V），轉(zhuǎn)至 PVDF 膜（300 mA，45 min），室溫封閉 1 h，加入 CHKA 一抗4℃ 孵育過(guò)夜，次日收集一抗，TBST 清洗5 次，5 min/次，加入相應(yīng)二抗孵育 2 h，TBST 漂洗 5 次，ECL顯影。

1.2.5 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 收集U87GSCs細(xì)胞懸液，離心，棄上清，采用含不同劑量DMSO 溶解的MN58b溶液（10、20、40 μmo/l L）重懸，1×104個(gè)/100 μl 鋪于96 孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，在各時(shí)間段加入10μl CCK8 溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)不同藥物濃度在不同時(shí)間點(diǎn)各孔450 nm處吸光度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用20μmo/l L MN58b溶液和DMEM溶液處理U87GSCs，培養(yǎng)48 h，收集上清中的細(xì)胞，預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌，離心，棄上清，500μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，在各處理管中加入5μl Annexin V-APC 和10μl 7-AAD，移液器吹打均勻，室溫下避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U87GSCs 陽(yáng)性表達(dá) CD133、Nestin 分子標(biāo)志物 免疫熒光結(jié)果顯示，將U87MG細(xì)胞重懸于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中24 h，可見(jiàn)部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中且聚集成不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)，48~72h期間半換液，腫瘤細(xì)胞團(tuán)逐漸呈圓球形生長(zhǎng)，折光性良好，提示U87MG 采用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后可形成類(lèi)似神經(jīng)干細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞球，其表面陽(yáng)性表達(dá)腫瘤干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物CD133 和神經(jīng)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物Nestin，表明神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的細(xì)胞球?yàn)榈湫虶SCs（圖1）。

圖1 U87GSCs免疫熒光結(jié)果（×200）Fig.1 U87GSCs immunofluorescence results（×200）

2.2 正常小膠質(zhì)細(xì)胞、GSCs 及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CH?KA 表達(dá) RT-PCR 結(jié)果顯示，U87GSCs、U87MG 細(xì)胞 CHKA 表達(dá)顯著高于 HMC3 細(xì)胞（F=31.3，P<0.001，圖 2A）。Western blot 結(jié)果顯示，U87GSCs、U87MG 細(xì)胞 CHKA 表達(dá)顯著高于 HMC3 細(xì)胞（F=5.24，P<0.05，圖2B、C）。

圖2 CHKA在U87GSCs、U87MG、HMC3細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 CHKA expressions in U87GSCs，U87MG，HMC3 cells

2.3 CHKA 抑 制 劑 MN58b 抑 制 U87GSCs 增殖 CCK8 結(jié)果顯示，隨 MN58b 濃度增加，U87GSCs 增殖能力逐漸被抑制（圖3），與0 mol/L MN58b 組相比，不同MN58b 濃度組各時(shí)間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，P<0.001）。隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，不同MN58b濃度對(duì)U87GSCs 增殖抑制率差異顯著，40 μmol/L MN58b作用72 h對(duì)U87GSCs增殖抑制最為明顯（F=18.33，P<0.05）。

圖3 MN58b對(duì)U87GSCs增殖的影響Fig.3 Effect of MN58b on proliferation of U87GSCs

表1 不同濃度MN58b對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間U87GSCs的抑制率比較（）Tab.1 Comparison of inhibition rates of different concen?trations of MN58b on U87GSCs in different cul?ture time（）

表1 不同濃度MN58b對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間U87GSCs的抑制率比較（）Tab.1 Comparison of inhibition rates of different concen?trations of MN58b on U87GSCs in different cul?ture time（）

Concentration 0 10μmol/ L 20μmol/ L 40μmol/ L F P 24 h 0.79±0.04 0.64±0.08 0.58±0.08 0.52±0.06 9.13<0.001 48 h 1.11±0.11 0.70±0.09 0.48±0.03 0.36±0.04 57.32<0.001 72 h 1.54±0.06 0.71±0.05 0.39±0.06 0.30±0.03 388.9<0.001 23.72 0.79 8.03 18.33 0.90 0.50<0.05<0.05 F P? ?? ?

2.4 MN58b 促進(jìn)U87GSCs 凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，加入DMSO 溶液的U87GSCs 凋亡率為1.87±0.45，加 入 CHKA 抑 制 劑 MN58b 溶 液 的U87GSCs 凋亡率為7.47±0.74，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=11.22，P<0.001，圖 4），提 示 CHKA 抑 制 劑MN58b可促進(jìn)U87GSCs凋亡。

圖4 DMSO和MN58b對(duì)U87GSCs凋亡的影響Fig.4 Effect of DMSO and MN58b on apoptosis of U87GSCs

3 討論

近年研究表明，GSCs可能是膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放化療產(chǎn)生耐受性，以及膠質(zhì)瘤預(yù)后不良和復(fù)發(fā)的根源［8-9］。但其發(fā)揮作用的具體作用機(jī)制尚未闡明，但可以確定的是GSCs 獨(dú)特的生物學(xué)特性與膠質(zhì)瘤對(duì)放化療不敏感、易復(fù)發(fā)密切相關(guān)［10］，如GSCs 可穩(wěn)定自我更新及高度增殖侵襲生長(zhǎng)，使其在周?chē)ＤX組織中不斷浸潤(rùn)生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除，而其極強(qiáng)的致瘤特性及高分化潛能使其比一般膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐放化療能力，因此，GSCs 作為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)已成為膠質(zhì)瘤研究重點(diǎn)。

CHKA 是膽堿激酶蛋白家族成員，在卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等人類(lèi)腫瘤形成過(guò)程中扮演重要角色，且在惡性腫瘤發(fā)展和預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11-12］。MN58b 是 CHKA 小分子抑制劑 HC-3 的衍生物，與HC-3一樣可抑制CHKA 活性從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，另外MN58b 還可加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而觸發(fā) 腫 瘤 細(xì) 胞 凋 亡［13］。 HERNáNDEZ-ALCOCEBA等［14］研究顯示，MN58b 作為 CHKA 抑制劑在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和移植瘤生長(zhǎng)過(guò)程中起明顯抑制作用。

課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多體素1H-MRS 參數(shù)膽堿/肌酸（Cho/Cr）代謝差異區(qū)域與膠質(zhì)瘤中腫瘤干細(xì)胞富集密切相關(guān)［15-16］。初步研究證實(shí)，Cho/Cr 低代謝區(qū)腦膠質(zhì)瘤組織中含有少量神經(jīng)GSCs，而Cho/Cr 高代謝區(qū)神經(jīng)GSCs含量明顯高于Cho/Cr低代謝區(qū)，神經(jīng)GSCs 分布與Cho 含量呈正相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，給予CHKA 特異性抑制劑MN58b，U87MG 增殖明顯被抑制，而其凋亡能力則被促進(jìn)。CHKA 作為Cho 代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶可能與GSCs發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其作用機(jī)制尚不明確，推測(cè)其可能通過(guò)對(duì)GSCs 生物功能的調(diào)節(jié)從而影響膠質(zhì)瘤不良預(yù)后。因此，課題組從不同細(xì)胞系入手發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及GSCs 中CHKA 表達(dá)明顯高于正常小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后采用CHKA 特異性抑制劑MN58b 降低CHKA 生物活性，并進(jìn)一步通過(guò)CCK8 實(shí)驗(yàn)證明CHKA的生物活性被抑制后U87GSCs增殖能力明顯被抑制，同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)U87GSCs 凋亡，發(fā)現(xiàn)CHKA活性被抑制后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，CHKA 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及GSCs 中表達(dá)明顯高于正常小膠質(zhì)細(xì)胞，且CHKA 生物活性被MN58b 抑制后可有效抑制GSCs 增殖，促進(jìn)其凋亡。因此，CHKA 可能是一種促癌基因，有望成為膠質(zhì)瘤診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物，而MN58b 作為CHKA 的特異性抑制物可以作為抑制CHKA 的靶向藥物，與目前膠質(zhì)瘤的治療藥物相結(jié)合可能將會(huì)有效抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)展，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。