李思瑩 周萍萍 齊艷秀 張 劍 王玉清 （佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，佳木斯154002）

視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）是一種常見致死性眼內(nèi)腫瘤，高發(fā)于兒童［1］。與其他惡性腫瘤相比，Rb發(fā)病率較低，但若治療不當則發(fā)展迅速，常發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，死亡率較高［2］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長度大于200 個核苷酸的缺乏蛋白編碼能力的RNA，通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因或通路發(fā)揮致癌基因或抑癌基因功能，與腫瘤細胞增殖、凋亡、周期阻滯和侵襲有關(guān)［3-4］。多個與腫瘤相關(guān)的lncRNA 參與Rb進展，并是Rb的診斷標志物和治療靶點［5］。LINC00467 是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)RNA，研究顯示，LINC00467高表達與結(jié)腸癌患者總體生存期、無復(fù)發(fā)生存期較短有關(guān)，下調(diào)LINC00467 表達可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移［6］。肝癌中 LINC00467 呈高表達，可抑制肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡［7］。生物信息學(xué)分析顯示，miR-495-3p 是LINC00467 的潛在靶基因。miR-495-3p 已被證實在骨肉瘤中具有抑癌基因作用［8］，但 LINC00467 是否具有抗 Rb 作用，其作用是否與調(diào)控miR-495-3p 表達有關(guān)尚未闡明。本研究探討 LINC00467、miR-495-3p 在 Rb 中的生物學(xué)作用，以期為Rb分子治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 人Rb 細胞系Y79（美國菌種保藏中心）；胎牛血清（美國Hyclone 公司）；RP?MI1640 培養(yǎng)液（美國Gibco 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）；PrimeScript RT 試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）；SYBR Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis 試劑盒（中國TaKaRa 公司）；LINC00467特異性小干擾RNA（si-LINC00467）、亂序無意義陰性對照序列（si-NC）、miR-495-3p 模擬物（miR-128-3p mimics）、模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-495-3p 抑制物（antimiR-182-5p）、抑制物對照（anti-NC）由上海吉瑪制藥公司提供；MTT（美國Sigma 公司）；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（上海鈺博生物公司）；兔抗人細胞周期素D1（CyclinD1）、p21、B 細胞淋巴瘤2（B cell lym?phoma 2，Bcl-2）、Bcl 相關(guān) X 蛋白（Bcl associated X protein，Bax）、GAPDH 抗體及山羊抗兔二抗（上海艾博抗公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.1.2 組織來源 收集2014 年至2018 年我院病理科確診的 25 例 Rb 標本，男性 14 例，女性 11 例，年齡6 個月~16 歲，另取25 例正常視網(wǎng)膜組織，男性18 例，女性 7 例，年齡 5~14 歲。Rb 標本在摘除手術(shù)中采集，術(shù)前均未接受放化療治療，正常視網(wǎng)膜組織來源于意外死亡捐獻者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有研究對象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 Y79 細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于6 孔板，當細胞密度達60%時按Lipofectamine 2000使用說明將si-NC、si-LINC00467、miR-NC、miR-495-3p mimics、si-LINC00467+anti-miRNC、si-LINC00467+anti-miR-495-3p 分別轉(zhuǎn)染至 Y79細胞，轉(zhuǎn)染48 h 時，檢測轉(zhuǎn)染效率，合格后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測 LINC00467 和 miR-495-3p 表達 采用TRIzol試劑提取Rb組織、正常視網(wǎng)膜組織總RNA，采用PrimeScript RT 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，分別采用SYBR Premix ExTaq、Mir-X miRNA First Strand Synthesis 試 劑 盒 測 定 LINC00467 和 miR-495-3p 表達，2?ΔΔCt法計算，LINC00467 以 GAPDH 為內(nèi)參，miR-495-3p 以 U6 為內(nèi)參，引物序列（5'-3'）：LINC00467 F：ATTGAAGATGCTGCCAAGGG，R：GCCCAGTTTCAGTCCCTCTT；GAPDH F：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA，R：AATGAAGGGGTCATTGATGG；miR-495-3p F：GCGGAAACAAACATGGTGCA；U6 F：TCCGATCGTGAAGCGTTC，R：GTGCAGGGTCCGAGGT。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖活力 轉(zhuǎn)染48 h 后，收集Y79 細胞，采用RPMI1640 培養(yǎng)基制備細胞密度為3×104個/ml的單細胞懸液，取0.1 ml細胞懸液加入96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，20 μ/l 孔加入MTT 試劑（5 mg/ml），反應(yīng)4 h，終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，150μ/l 孔加入二甲基亞砜，搖床低速振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm 處各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h 后，收集Y79 細胞，采用1×結(jié)合緩沖液制備細胞密度為1×108個/ml 的單細胞懸液，取0.1 ml 細胞懸液加入至流式管內(nèi)，分別加入5μl Annexin V-FITC和PI，避光反應(yīng)15 min，補加400 μl 1×結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 合成含有miR-495-3p 結(jié)合位點的LINC00467 野生型序列或突變位點的突變序列，并將野生型/突變型LINC00467 序列克隆至pmirGLO 雙熒光素酶載體，WT-LINC00467、MUT-LINC00467 由上海吉瑪公司構(gòu)建。采用Lipo?fectamine 2000 將報告載體WT-LINC00467 或MUTLINC00467 分 別 與 miR-495-3p mimic 或 miR-NC 共轉(zhuǎn)染至Y79細胞，轉(zhuǎn)染48 h，雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)測定各組細胞相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗均設(shè)置3個平行實驗，重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)以表示。采用 SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rb 組織中 LINC00467 和 miR-495-3p 表達 與正常視網(wǎng)膜組織（1.00±0.06）、（1.02±0.09）相比，Rb 組織中 LINC00963 表達（4.22±0.41）顯著升高，miR-495-3p表達（0.58±0.05）顯著降低（P<0.05）。

2.2 抑制LINC00467 表達對 Y79 細胞增殖的影響 與轉(zhuǎn)染si-NC 組相比，轉(zhuǎn)染si-LINC00467 后Y79細胞LINC00467 表達顯著降低（P<0.05），表明Y79細胞中LINC00467表達受抑制。抑制LINC00467表達，Y79 細胞24~72 h 細胞活力顯著降低，CyclinD1蛋白表達顯著降低，p21 蛋白表達顯著升高（P<0.05），見圖1、表1。

表1 抑制LINC00467表達對Y79細胞增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00467 on proliferation of Y79 cells（，n=9）

表1 抑制LINC00467表達對Y79細胞增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00467 on proliferation of Y79 cells（，n=9）

Groups LINC00467 OD490 CyclinD1 protein p21 protein si-NC si-LINC00467 t P 1.01±0.06 0.43±0.04 24.129 0.000 24 h 0.29±0.03 0.24±0.03 3.536 0.003 48 h 0.53±0.05 0.37±0.04 7.496 0.000 72 h 0.81±0.08 0.49±0.04 10.733 0.000 0.65±0.06 0.24±0.03 18.336 0.000 0.18±0.02 0.58±0.05 22.283 0.000

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

2.3 抑制LINC00467 表達對Rb 細胞Y79 凋亡的影響 與si-NC 組（6.25±0.63）、（0.75±0.07）、（0.27±0.03）相比，抑制 LINC00467 表達，Y79 細胞凋亡率（23.47±2.33）顯著升高，Bcl-2 蛋白表達（0.31±0.03）顯著降低，Bax 蛋白表達（0.69±0.06）顯著升高（P<0.05），見圖2。

圖2 抑制LINC00467表達對Y79細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibiting LINC00467 on apoptosis of Y79 cells

2.4 LINC00467 靶向調(diào)控 miR-495-3p 表達 Lnc?Base Predicted v. 2 網(wǎng)站在線預(yù)測顯示，LINC00467與miR-495-3p 存在連續(xù)互補的結(jié)合位點（圖3）。雙熒光素酶報告顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 和WT-LINC 00467 共轉(zhuǎn)染組（1.00±0.06）相比，miR-495-3p mim?ics 和 WT-LINC00467 共轉(zhuǎn)染組（0.52±0.05）Y79 細胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與轉(zhuǎn)染miRNC 和MUT-LINC00467 共轉(zhuǎn)染組（1.04±0.07）相比，miR-495-3p mimics 和 MUT-LINC00467 共 轉(zhuǎn) 染 組Y79 細胞熒光素酶活性（1.01±0.08）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot 檢測顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA 組（1.00±0.05）相比，轉(zhuǎn)染 pcDNA-LINC00467 后 Y79細胞miR-495-3p 表達（0.55±0.04）顯著降低；與轉(zhuǎn)染 si-NC 組（0.98±0.07）相比，轉(zhuǎn)染si-LINC00467 后Y79 細胞 miR-495-3p 表達（2.79±0.27）顯著升高（P<0.001）。

圖3 LINC00467 序列中存在與miR-495-3p 互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of LINC00467 contains a nucleotide se?quence complementary to miR-495-3p

2.5 miR-495-3p過表達對Rb 細胞Y79增殖和凋亡的影響 與轉(zhuǎn)染miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimic 后 Y79 細胞 miR-495-3p 表達顯著升高（P<0.05），表明 Y79 細胞 miR-495-3p 表達上調(diào)成功。過表達 miR-495-3p，Y79 細胞 24~72 h 活力顯著降低，凋亡率顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達顯著降低，p21 和Bax 蛋白表達顯著升高（P<0.05），見圖4、表2。

表2 miR-495-3p過表達對Y79細胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effects of overexpressing miR-495-3p on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

表2 miR-495-3p過表達對Y79細胞增殖和凋亡的影響（，n=9）Tab.2 Effects of overexpressing miR-495-3p on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

Groups miR-495-3p OD490 p21 protein Bcl-2 protein Bax protein miR-NC miR-495-3p t P 1.00±0.06 3.11±0.29 21.375 0.000 24 h 0.28±0.03 0.26±0.03 1.414 0.176 48 h 0.56±0.05 0.41±0.04 7.028 0.000 72 h 0.86±0.07 0.53±0.05 11.509 0.000 Apoptosis rate（%）7.25±0.72 19.47±1.82 18.730 0.000 CyclinD1 protein 0.64±0.06 0.29±0.03 15.652 0.000 0.19±0.02 0.54±0.05 19.498 0.000 0.77±0.07 0.36±0.03 16.151 0.000 0.26±0.03 0.65±0.06 17.441 0.000

圖4 miR-495-3p過表達對Y79細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of overexpressing miR-495-3p on prolifera?tion and apoptosis of Y79 cells

2.6 抑制miR-495-3p 表達逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467 對Rb 細胞Y79 增殖和凋亡的作用 如圖5、表3 所示，與轉(zhuǎn)染 si-NC 相比，轉(zhuǎn)染 si-LINC00467 后 Y79 細胞miR-495-3p表達顯著升高，24~72 h時細胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達顯著降低，p21 和Bax 蛋白表達顯著升高；與轉(zhuǎn)染si-LINC00467+anti-miR-NC 相比，轉(zhuǎn)染 si-LINC00467+anti-miR-495-3p 后 Y79 細胞 miR-495-3p 表達顯著降低，24~72 h時細胞活力顯著升高，凋亡率顯著降低，CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達顯著升高，p21 和 Bax 蛋白表達顯著降低（P<0.05）。

圖5 下調(diào)miR-495-3p 表達逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467 對Y79 細胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Down-regulating miR-495-3p reverses effect of in?hibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells

表3 下調(diào)miR-495-3p表達逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467對Y79細胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.3 Down-regulating miR-495-3p reversed effect of inhibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

表3 下調(diào)miR-495-3p表達逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467對Y79細胞增殖和凋亡的作用（，n=9）Tab.3 Down-regulating miR-495-3p reversed effect of inhibiting LINC00467 on proliferation and apoptosis of Y79 cells（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with si-LINC00467+anti-miR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-495-3p Apoptosis rate（%）CyclinD1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein si-NC 1.01±0.06 OD490 24 h 0.28±0.03 48 h 0.55±0.05 72 h 0.84±0.087.65±0.740.64±0.060.17±0.020.76±0.070.28±0.03 si-LINC00467 si-LINC00467+anti-miR-NC si-LINC00467+anti-miR-495-3p 2.75±0.271）0.23±0.031）0.38±0.041）2.79±0.28 1.43±0.142）0.22±0.02 0.27±0.022）0.34±0.03 0.49±0.042）0.51±0.051）0.46±0.04 0.72±0.072）22.41±2.241）24.63±2.45 11.05±1.172）0.25±0.031）0.23±0.03 0.53±0.052）0.57±0.051）0.59±0.06 0.29±0.032）0.32±0.031）0.30±0.03 0.64±0.052）0.67±0.061）0.68±0.07 0.39±0.042）171.33512.00051.27374.396193.899190.291210.649208.043132.764 0.000 F P 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

3 討論

近年研究表明，lncRNA 在Rb 進展中具有重要作用。WANG等［9］研究表明，下調(diào)核豐富的轉(zhuǎn)錄本1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）可顯著抑制Rb 細胞增殖、細胞周期進展，增強caspase-3和 caspase-9 活性，促進細胞凋亡。LI 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外抑制LINC00152均可顯著抑制Rb細胞生長。本研究揭示了LINC00467在Rb中的作用，并證實其作用發(fā)揮與調(diào)控miR-495-3p表達有關(guān)。

LINC00467 位于染色體1q32.3 區(qū)域，全長2 616 nt。研究顯示，LINC00467 在膠質(zhì)瘤、肺腺癌、宮頸癌等多種癌癥中表達上調(diào)，促進腫瘤細胞增殖和遷移，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，表明LINC00467在上述類型腫瘤中起抑癌基因作用［11-14］。但LINC00467 在Rb 中的表達和作用鮮有報道。本研究顯示，LINC00467 在Rb 組織中表達上調(diào)，提示LINC00467可能參與Rb 進展。此外，本研究驗證了LINC00467的生物學(xué)功能，表明抑制LINC00467 表達可顯著抑制Y79細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。增殖、凋亡關(guān)鍵蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，抑制LINC00467 表達可降低CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達，升高 p21 和 Bax 蛋白表達，表明LINC00467在Rb中起致癌基因作用。

lncRNA 通過與miRNA 結(jié)合降低其表達發(fā)揮ceRNA 功能是其參與腫瘤調(diào)控的重要機制。研究顯示，核內(nèi)小RNA 宿主基因16（small nuclear RNA host gene 16，SNHG16）通過海綿miR-140-5p 促進人Rb 進展［15］；抑制同源盒基因 A11 反義 RNA（homolo?gous box gene A11 antisense RNA，HOXA11-AS）通過上調(diào)miR-506-3p 表達可明顯抑制Rb 細胞增殖，誘導(dǎo)細胞周期G/1G0期阻滯，促進細胞凋亡［16］。本研究以miR-495-3p 作為LINC00467 的下游靶點，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、RT-qPCR 證實LINC00467對miR-495-3p的靶向負調(diào)控作用。既往研究顯示，miR-495-3p 在結(jié)腸癌、黑色素瘤中表達下調(diào)，抑制NEAT1通過上調(diào)miR-495-3p可觸發(fā)結(jié)腸癌細胞凋亡，抑制黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲［17-18］。此外，miR-495-3p 還是胃癌細胞自噬平衡和多藥耐藥的重要調(diào)節(jié)因子［19］。本研究顯示，miR-495-3p 在Rb 組織中表達降低，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimics 上調(diào)其表達可抑制Y79 細胞增殖，抑制Cy?clinD1 和 Bcl-2 表達，促進 p21 和 Bax 表達，誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，恢復(fù)實驗顯示，抑制miR-140-5p 表達可逆轉(zhuǎn)抑制LINC00467對Y79細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。表明LINC00467 通過miR-140-5p 參與Y79細胞增殖和凋亡調(diào)控。

綜上所述，本研究表明，LINC00467 在 Rb 中表達上調(diào)，通過與miR-506-3p 直接作用在Rb 發(fā)生中發(fā)揮致癌作用。因此，LINC00467 有望成為Rb 潛在治療靶點。