薛凱兵， 李志剛， 魏永杰

中國環(huán)境科學研究院， 環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室， 北京 100012

空氣污染被認為是導致心血管疾病的主要影響因素之一，并與多種心血管疾病風險相關(guān)[1]. 研究[2-6]指出，大氣顆粒物是空氣污染誘發(fā)不良健康效應(yīng)(尤其是對心血管系統(tǒng)的影響)的主要原因. 流行病學研究[7-8]提示，大氣顆粒物的短期、長期暴露均與缺血性心臟病、心力衰竭、缺血性/血栓性腦卒中等心血管疾病的死亡風險增加有關(guān)聯(lián). 毒理學研究[9-10]表明，大氣顆粒物對心血管影響的主要生物學機制有3種：①肺部產(chǎn)生的促炎癥或氧化應(yīng)激介質(zhì)溢出到全身循環(huán)；②促進自主神經(jīng)系統(tǒng)失衡；③大氣顆粒物組分直接滲透到心血管組織中發(fā)生反應(yīng). 大氣顆粒物暴露后通過這3種機制介導的血液凝結(jié)被認為可能是導致心血管疾病風險增加的主要原因之一. 凝血級聯(lián)活化作為機體血液凝結(jié)最基礎(chǔ)的部分，必然參與到大氣顆粒物暴露后的血液凝結(jié)過程中. 為了明確大氣顆粒物對心血管疾病的作用過程，預防和最大限度地減少大氣顆粒物暴露對健康的危害，有必要深入了解大氣顆粒物如何誘導血液凝結(jié). 該文綜述了凝血級聯(lián)活化在大氣顆粒物誘導血液凝結(jié)中的關(guān)鍵作用，主要討論了大氣顆粒物暴露對外源性和內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路的影響，以期為凝血級聯(lián)活化與大氣顆粒物引發(fā)心血管疾病的關(guān)聯(lián)提供理論基礎(chǔ).

1 凝血級聯(lián)在大氣顆粒物促凝效應(yīng)中的重要性

在高等生物體內(nèi)，凝血級聯(lián)被激活以形成纖維蛋白凝塊來制止血管損傷后的失血. 凝血級聯(lián)是指凝血因子的裂解活化并激活通路中的后續(xù)蛋白酶，逐級反應(yīng)最終產(chǎn)生纖維蛋白的過程[11]. 在早期模型中，凝血級聯(lián)反應(yīng)分為外源性通路和內(nèi)源性通路. 在外源性通路中，組織因子(tissue factor, TF)作為啟動因子與因子Ⅶ (FⅦ)結(jié)合形成TF-Ⅶa復合物，進一步激活因子Ⅹ (FⅩ). 在內(nèi)源性通路中，因子Ⅻ (FⅫ)與帶負電荷的表面接觸后，轉(zhuǎn)化為活化的FⅫa，再依次激活因子Ⅺ、因子Ⅸ和因子Ⅹ[12]. 然后，二者匯合成共同通路，F(xiàn)Ⅹa、凝血酶原(prothrombin, FⅡ)和輔助因子Ⅴa組裝成凝血酶激活劑復合物，該激活劑激活凝血酶，最終將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白[12]. 然而，隨著早期模型無法解釋新出現(xiàn)的問題，Hoffman等[11,13]重塑了凝血級聯(lián)，新的凝血理論指出機體止血過程包含發(fā)生在不同細胞表面的3個重疊階段：①凝血在攜帶組織因子的細胞上啟動；②產(chǎn)生的少量凝血酶激活血小板；③凝血過程在激活的血小板表面延伸，產(chǎn)生大量凝血酶. 基于細胞的凝血級聯(lián)理論[13]表明，內(nèi)源性通路和外源性通路其實并不是兩條完全獨立的凝血路徑，二者同時在不同的細胞表面平行運行，因此血液正常流動平衡過程涉及多種循環(huán)血細胞、各種凝血因子、血小板、纖維蛋白溶解因子、血管壁以及內(nèi)皮細胞衍生介質(zhì)之間的相互作用. 研究[14-16]表明，大氣顆粒物暴露會影響這些保持血液正常流動平衡的各種因子，進而打破機體血液流動平衡. 已有研究中大氣顆粒物暴露后主要影響的凝血蛋白或指標如表1所示，具體包括：①凝血因子表達變化，如TF[14-19]、凝血酶(thrombin，F(xiàn)Ⅱa)[20]、FⅩa[19]、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)Ⅰ)表達增加[21-24]，F(xiàn)Ⅷ、FⅩ、FⅡ活性增加[20]以及組織因子通路抑制劑(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)表達減少[25]. ②纖維蛋白溶解調(diào)控蛋白表達變化，如組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)表達減少[26-28]，纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor1，PAI-1)表達增加[29-30]. ③血小板活化標志物表達增加，包括可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40)[31-33]、可溶性P選擇素(soluble P-selectin，CD62p)[34-35]和血管性假血友病因子(von willebrand factor，vWF)[29]. 該文歸納了大氣顆粒物暴露誘發(fā)的凝血效應(yīng)，主要包括凝血結(jié)形成、纖維蛋白溶解抑制和血小板活化，且這3種凝血效應(yīng)均與凝血級聯(lián)活化有關(guān)[36]. 凝血級聯(lián)是凝血結(jié)形成的一個組成部分. 大氣顆粒物暴露誘導凝血因子表達增加，通過凝血級聯(lián)反應(yīng)生成纖維蛋白，纖維蛋白集聚，從而形成凝血結(jié). 纖維蛋白溶解主要受組織纖溶酶原激活物調(diào)控. 大氣顆粒物暴露后，通過凝血級聯(lián)反應(yīng)誘導生成的凝血酶能夠促進纖溶酶原激活物抑制劑表達的增加，進而抑制了纖維蛋白溶解[36]. 此外，大氣顆粒物暴露后通過凝血級聯(lián)產(chǎn)生的凝血酶可以促進血小板聚集，使血小板活化. 綜上，凝血級聯(lián)的活化在大氣顆粒物暴露誘導的血液凝結(jié)中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用，從而與大氣顆粒物暴露后心血管疾病的發(fā)病密切相關(guān).

表1 大氣顆粒物暴露誘發(fā)的凝血效應(yīng)

凝血級聯(lián)活化在大氣顆粒物暴露誘導血液凝結(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此有必要探究大氣顆粒物暴露對凝血級聯(lián)活化的影響. 區(qū)分大氣顆粒物暴露激活的凝血級聯(lián)與人體正常止血過程中凝血級聯(lián)活化過程的異同，明確大氣顆粒物暴露激活凝血級聯(lián)反應(yīng)的機制，是亟待厘清的科學問題.

2 PM暴露對凝血級聯(lián)通路的影響

目前，科學家們已經(jīng)開展了一些關(guān)于大氣顆粒物暴露激活凝血級聯(lián)的研究，該文綜述了大氣顆粒物暴露對外源性或內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路的影響.

2.1 PM暴露對外源性凝血通路的影響

TF作為外源性通路的啟動因子，成為首要的研究對象. 在健康的機體中，TF在器官和體表的血管周圍細胞和上皮細胞內(nèi)表達. 內(nèi)皮屏障的破壞使血管外TF暴露于血液中，進而激活凝血通路[37]. 然而，體內(nèi)和體外研究均表明，大氣顆粒物暴露也會增加TF的表達，進而激活外源性凝血通路[17-18]. 暴露于PM2.5后，小鼠血液中TF和凝血因子FⅩ的水平均明顯升高，并在肺組織中觀察到纖維蛋白沉積[19]. 近期研究[16]發(fā)現(xiàn)，納米級顆粒暴露導致內(nèi)皮細胞中調(diào)控凝血級聯(lián)反應(yīng)的蛋白(TF和t-PA)表達異常，產(chǎn)生促凝效應(yīng). 研究已經(jīng)明確大氣顆粒物暴露誘導TF表達上調(diào)，但介導TF表達增加的機制尚不清楚.

作為大氣顆粒物對心血管系統(tǒng)損害的主要機制，炎癥反應(yīng)也是大氣顆粒物暴露后產(chǎn)生促凝效應(yīng)的關(guān)鍵原因. 炎癥反應(yīng)對外源性凝血級聯(lián)通路活化的貢獻在于各種炎性因子可誘導內(nèi)皮細胞和血細胞表達TF[38]. Seaton等[39]在1995年假設(shè)大氣顆粒物污染與心肺疾病高危人群死亡的關(guān)聯(lián)可能是由沉積在肺泡中的超細顆粒引發(fā)肺泡炎癥，從而激活凝血級聯(lián)所致. 直到2005年，Gilmour等[40]證實了這一假說的可能性，其發(fā)現(xiàn)可吸入顆粒物暴露后巨噬細胞中炎癥因子白細胞介素-8和TF的表達均增加，從而激活了外源性凝血通路，顯著縮短了凝血時間. 研究[40]認為，大氣顆粒物暴露會引起炎癥，促成外源性凝血通路的活化. 近期研究[16,19]表明，PM2.5可引發(fā)炎癥反應(yīng)進而激活TF調(diào)控的外源性凝血級聯(lián)，從而誘導血液凝結(jié). Liang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于PM2.5后，小鼠血液中促炎因子和黏附分子白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β、CRP、TF和凝血因子FⅩ的表達水平均明顯升高，并在肺組織中觀察到纖維蛋白沉積. Li等[16]研究表明，空氣中的納米級顆?？赏ㄟ^活性氧誘導的炎癥激活內(nèi)皮細胞，并進一步導致參與凝血級聯(lián)的凝血相關(guān)蛋白(TF和t-PA)表達的異常. 在眾多可能誘發(fā)大氣顆粒物促凝效應(yīng)的炎癥反應(yīng)物種中，對炎癥因子IL-6的研究較多. Mutlu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，敲除IL-6基因的小鼠可免受可吸入顆粒物誘導的血管內(nèi)凝血酶的形成以及動脈血栓形成加速的影響，證實小鼠暴露于可吸入顆粒物后促血栓狀態(tài)的形成需要肺泡巨噬細胞釋放IL-6. 此外，有研究[41]指出，IL-6的促凝機制包括增加促凝蛋白(包括FⅠ、TF、FⅧ和von Willebrand因子)的轉(zhuǎn)錄表達以及減少抗凝蛋白(蛋白S和抗凝血酶)的轉(zhuǎn)錄.

然而，TF抗原的測定并不一定能反映TF的功能和反應(yīng)活性，因為血液中存在微量的血源性TF[42-43]. 血源性TF由細胞活化和凋亡脫落形成的微泡(microparticles，MPs)所攜帶[44]. MPs因包含磷脂表面和攜帶促凝蛋白TF具有極高促凝活性[45]. 磷脂表面可為凝血酶激活復合物的組裝提供條件[46]. 健康捐獻者血液中的血源性TF水平極低，而在各種疾病患者中血源性TF水平升高[47]. 此外，部分血源性TF的非活性前體在受到刺激后發(fā)生構(gòu)象變化，使TF與活化的FⅦ結(jié)合并激活FⅩ[48]. 鑒于此，科學家探索了大氣顆粒物的促凝效應(yīng)與循環(huán)MPs的關(guān)聯(lián)性. Vermylen等[49]于2006年提出吸入空氣污染物可能會誘導骨髓中攜帶TF的造血細胞進入血液循環(huán)系統(tǒng). Bonzini等[50]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度大氣顆粒物暴露會導致凝血酶原時間縮短、內(nèi)源性凝血酶生成潛能增加，但凝血和纖溶標志物無顯著變化. 筆者推測循環(huán)血小板活化單核細胞產(chǎn)生的MPs可能介導了這種凝血效應(yīng). 此外，有研究[51]指出，在非吸煙的糖尿病患者中，機體循環(huán)MPs的增加與大氣顆粒物暴露有關(guān). 同時，富含MP的血漿中纖維蛋白原和凝血酶的升高也與大氣顆粒物暴露有關(guān). 近期研究[52]證實，單核細胞和內(nèi)皮細胞暴露于大氣顆粒物后，可增加MPs的產(chǎn)生. 這些MPs攜帶具有功能活性的TF，因此可以觸發(fā)外源性凝血級聯(lián)通路的活化，從而導致血栓性疾病. 因此，大氣顆粒物暴露后MP數(shù)量和促凝血潛能的增加可能是誘導凝血效應(yīng)的原因之一.

綜上，大氣顆粒物暴露可以誘導血液中TF含量的增加，進而活化外源性凝血級聯(lián)通路. TF增加的機制主要包括炎癥反應(yīng)介導的TF表達，以及源自循環(huán)MPs的血源性TF的增加. 但相關(guān)研究仍需從以下幾個方面加強：①目前外源性通路的活化主要根據(jù)大氣顆粒物暴露后TF的上調(diào)來推測，已有研究鮮有關(guān)注凝血通路中所有凝血因子的變化以及凝血因子之間的調(diào)控關(guān)系，尚未確切證實大氣顆粒物暴露后外源性凝血通路的活化. ②多數(shù)研究表明，炎癥反應(yīng)可能介導了大氣顆粒物暴露后TF表達的增加，但TF的來源和完整的炎癥調(diào)控機制尚不清楚. 深入探索炎癥反應(yīng)介導凝血級聯(lián)活化的機制有助于干預大氣顆粒物引發(fā)的心血管疾病. ③為明確大氣顆粒物暴露激活外源性凝血級聯(lián)通路的機制，仍需探索炎癥反應(yīng)介導的TF表達與血源性TF增加對激活外源性凝血級聯(lián)通路的貢獻.

2.2 PM暴露對內(nèi)源性凝血通路的影響

傳統(tǒng)理論認為，外源性凝血通路在機體的止血平衡中起主要作用[53]. 然而，F(xiàn)Ⅶ激活FⅨ以及FⅠa激活FⅪ的認識打破了原有的止血理論[54-55]. 在機體的止血平衡中，外源性通路和內(nèi)源性通路并非完全獨立. 但FⅫ作為機體內(nèi)源性通路的啟動因子，其作用仍存在爭論[56]，主要原因有2個：① FⅫ的先天性缺乏與人類或小鼠的出血無關(guān)；②體內(nèi)缺乏合適的表面來支持FⅫ的活化[57]. 最初認為FⅫ激活內(nèi)源性凝血通路可以由人工表面(如玻璃、高嶺土、碳酸鋇等)介導[58]，但一些天然或生理表面，如血小板聚磷酸鹽、錯誤折疊的蛋白質(zhì)和膠原蛋白等，也被證實支持FⅫ的活化[59]. 研究[60-62]表明，包含復雜成分的大氣顆粒物同樣能夠接觸激活FⅫ，進而激活內(nèi)源性凝血通路產(chǎn)生凝血效應(yīng).

與外源性通路相比，大氣顆粒物暴露對內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路的影響研究起步較晚. Kilinc等[60]于2011年報道了FⅫ和內(nèi)源性激活通路在大氣顆粒物持續(xù)促凝反應(yīng)中的作用. 與正常血漿比，體外暴露于大氣超細顆粒物的人先天性FⅫ缺陷血漿的凝血酶生成潛能被抑制，氣管內(nèi)灌注大氣超細顆粒物的FⅫ基因敲除(FⅫ-/-)小鼠血漿的凝血酶生成潛能同樣受到抑制，表明人類長期暴露于大氣超細顆粒物后血液凝結(jié)風險的增加可能與FⅫ調(diào)控的凝血酶形成有關(guān)[60]. 一項更有說服力的研究[61]表明，高濃度大氣細顆粒物通過激活激肽釋放酶激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)來調(diào)節(jié)內(nèi)源性的凝血通路，具體為KKS的初始因子FⅫ與大氣顆粒物樣品的結(jié)合實現(xiàn)了FⅫ的自我活化，使血漿激肽前體(plasma prekallikrein，PPK)轉(zhuǎn)化為血漿激肽(plasma kallikrein，PK)，然后裂解高分子量激肽原(high molecular-weight kininogen, HK)，釋放出具有生物活性的多肽緩激肽. PK對FⅫ的激活產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)作用，從而放大KKS系統(tǒng)的激活作用[63]. 大量FⅫa會將FⅪ活化，從而引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)事件，最終導致凝血酶生成. 此外，Wang等[62]進一步證實了KKS系統(tǒng)在大氣細顆粒物誘導內(nèi)源性凝血系統(tǒng)活化中的作用. 大氣細顆粒物暴露后，PK基因敲除小鼠血漿中凝血酶-抗凝血酶復合物的水平以及凝血酶生成潛勢均較正常小鼠顯著降低；同時，添加前激肽釋放酶抗體可消除PM2.5誘導的正常人血漿中凝血酶的生成[63]. 綜上，大氣細顆粒物能激活KKS系統(tǒng)進而活化內(nèi)源性凝血通路，介導凝血酶生成. 目前大氣顆粒物對內(nèi)源性凝血通路的影響研究尚有不足，在未來流行病學和毒理學研究中需側(cè)重關(guān)注大氣顆粒物暴露誘導機體FⅫ和FⅫa的表達變化，以期更全面地掌握大氣顆粒物對內(nèi)源性凝血路徑的影響.

上述研究多是基于大氣顆粒物處理后的離體試驗或體外試驗. 這些研究的基礎(chǔ)是假設(shè)血液循環(huán)中存在大氣顆粒物，對于大氣顆粒物是否進入血液以及哪些組分誘導了血液凝結(jié)效應(yīng)，科學家們一直在不斷探索. Nemmar等[64]證明，作為空氣超細顆粒的替代品，小鼠氣管內(nèi)灌注的放射性標記白蛋白納米膠體顆粒能迅速從肺部擴散到全身循環(huán). 近期有研究[65]發(fā)現(xiàn)，金納米顆?？梢赃M入人和小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng). 盡管是超細顆粒的替代品，這些顆粒在體內(nèi)的可觀察性表明,大氣顆粒物可能進入血液. 在未來研究中，深入探索大氣顆粒物在血液中的遷移情況是非常有必要的. 此外，目前僅有個別研究探討大氣顆粒物中單個組分對FⅫ的激活作用. Jin等[61]研究發(fā)現(xiàn)，帶負電荷的二氧化硅顆粒和脂多糖處理可導致血漿激肽釋放酶的形成，并證實大氣顆粒物中的顆粒態(tài)物質(zhì)和內(nèi)毒素是誘導KKS活化的原因. Mutch等[66]研究發(fā)現(xiàn)，固定化的Ni2 +和Cu2 +以高親和力結(jié)合FⅫ、FⅪ和HK，從而刺激KKS的活化，激活FⅫ介導的凝血通路. 大氣顆粒物中包含的過渡金屬對內(nèi)源性通路的活化可能是大氣顆粒物暴露激活內(nèi)源性凝血通路的機制之一.

研究大氣顆粒物暴露對內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路的影響，不僅有助于全面理解大氣顆粒物暴露對凝血級聯(lián)通路的影響，也為研究FⅫ介導的內(nèi)源性凝血通路在健康機體中的作用提供了契機. 目前體外和體內(nèi)研究表明，大氣顆粒物暴露激活FⅫ，然后通過KKS系統(tǒng)放大信號，進而激活內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路，從而調(diào)控下游凝血酶形成；同時，內(nèi)源性凝血通路研究[67]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅻ的缺失與人類和動物止血異常無關(guān)，但在動脈損傷模型中FⅫ的缺失會損害閉塞性血栓的形成. 抑制FⅫ是一項可選擇且安全的預防腦卒中和其他血栓栓塞性疾病的策略[68]. 根據(jù)大氣顆粒物暴露研究和內(nèi)源性凝血通路研究的結(jié)論，筆者推測 FⅫ 誘導的內(nèi)源性凝血通路的活化在大氣顆粒物誘發(fā)血栓類心血管疾病中發(fā)揮作用. 在今后的研究中，大氣顆粒物引發(fā)心血管疾病發(fā)病風險在FⅫ缺乏人群與正常人群之間的區(qū)別值得關(guān)注. 研究敲除FⅫ基因或 FⅫ 表達抑制對大氣顆粒物調(diào)控內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路的影響,可為未來衛(wèi)生干預措施提供依據(jù).

3 結(jié)論與展望

a) 血液凝結(jié)是大氣顆粒物暴露引發(fā)心血管疾病的重要機制. 大氣顆粒物暴露誘發(fā)的凝血效應(yīng)包括凝血結(jié)形成、纖維蛋白溶解抑制及血小板活化，三者均與凝血級聯(lián)密切相關(guān). 因此，闡明大氣顆粒物暴露誘發(fā)凝血級聯(lián)活化機制有助于理解凝血效應(yīng)的產(chǎn)生，進而為未來干預大氣顆粒物引發(fā)的心血管疾病提供基礎(chǔ).

b) 大氣顆粒物暴露可激活凝血級聯(lián)通路. 對外源性路徑的影響主要表現(xiàn)為大氣顆粒物誘導起始因子TF表達上調(diào)，其主要機制包括炎性反應(yīng)介導的TF表達增加以及源自循環(huán)MPs的血源性TF增加. 對內(nèi)源性路徑的影響主要表現(xiàn)為大氣顆粒物接觸激活起始因子FⅫ，活化KKS系統(tǒng)，促進凝血酶生成.

c) 盡管已有證據(jù)表明大氣顆粒物暴露誘發(fā)凝血級聯(lián)活化，但相關(guān)研究仍需從以下幾個方面加強：①目前多數(shù)研究指出，大氣顆粒物暴露后，外源性或內(nèi)源性凝血級聯(lián)通路中少數(shù)凝血因子上調(diào)，尚需對凝血級聯(lián)通路上所有凝血因子分析并展開級聯(lián)調(diào)控關(guān)系驗證. ②大氣顆粒物暴露誘發(fā)的凝血級聯(lián)是否與正常機體的凝血級聯(lián)有所區(qū)別，外源性通路與內(nèi)源性通路之間是否存在聯(lián)系，均有待分析研究. ③目前研究結(jié)果主要來自動物暴露模型、細胞暴露模型以及體外試驗，而大氣顆粒物暴露誘發(fā)凝血因子表達變化的人群流行病學研究仍需加強.